[发明专利]竹叶抗氧化肽的分离与纯化方法

摘要

本发明公开了竹叶抗氧化肽的分离与纯化方法，它涉及竹叶营养、功能成分的提取技术领域，它的分离与纯化方法为：(1)、竹叶粗蛋白的提取；(2)、离子层析：(3)、凝胶过滤层析；(4)、超氧阴离子自由基清除能力测定；(5)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：(a)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；(b)、相对分子质量的计算；(6)、反相高效液相色谱。它利用了蛋白质的不同性质处理大量的高浓度的多肽蛋白质溶液，进行简单分离的同时使多肽蛋白浓缩，条件温和、操作简便，杂质少，为保健和医疗行业提供更多的资源，实用性强。

主权项

竹叶抗氧化肽的分离与纯化方法，其特征在于：它的分离与纯化方法为：(1)、竹叶粗蛋白的提取：准确称取竹叶粉20克于干净烧杯中，料液比1:20加入pH7.2、4℃预冷50mmol/L磷酸缓冲液400ml，搅拌均匀在4℃层析柜或冰箱中静置12小时，经纱布过滤去掉残渣，滤液经过冷冻离心(4℃，8000g，20min)，留取上清液，待用；采用硫酸铵沉淀法初步提取竹叶中的多肽蛋白，将固体硫酸铵缓慢加入到上清液中至终浓度为40％饱和度，同时使用磁力搅拌器缓慢搅拌，然后静置1h以上，在4℃、10000g离心15min，弃去沉淀，收集上清液，在40％饱和度的硫酸铵上清液中加固体硫酸铵至80％饱和度，静置1h以上，在4℃、10000g离心15min，收集沉淀，用10ml磷酸缓冲液溶解所得沉淀即得到竹叶蛋白粗提液；将80％硫酸铵盐析的蛋白粗提液，装入去离子水清洗过的透析袋，用pH7.2、50mmol/L磷酸缓冲液4℃下进行透析除盐，中间多次更换缓冲液，透析好的粗提液4℃保存备用，对所得的粗提样品进行超氧阴离子清除自由基能力检测；(2)、离子层析：(a)、DEAE‑Sephadex A‑50的处理和层析柱的填装：称取一定量的DEAE‑Sephadex A‑50，用起始缓冲液(50mmol/L磷酸缓冲液，pH7.2)浸泡，沸水浴2h，完全溶胀之后，用起始缓冲液清洗并采用倾倒法除去其中的细小颗粒，将处理好的离子交换剂上柱，利用重力沉降法装填1.6cm×18cm柱子，装填好的层析柱致密均匀、无气泡，最终柱体积为16ml，将层析柱与起始缓冲液储液器，恒流泵和紫外检测仪相连(λ＝280nm，0.05A)，检测密闭性并用起始缓冲液洗脱层析柱，使其达到交换平衡，并将紫外检测仪调零，为保持蛋白质活性，试验操作可在4℃层析柜中进行，另外此时所有设备和试剂均应在4℃预冷；(b)、加样：样品经过冷冻离心(10000g，15min，4℃)除去颗粒物，取澄清液，加样前先将层析柱上端拧开，利用重力作用将床面多余的缓冲溶液自然排干，当床面刚好暴露时将层析柱下端阀门关闭此时柱内液体不能流出，用吸管将预处理好的样品加到床面上，此时不能破坏床面的平整，以免造成区带的扭曲和倾斜，然后打开柱下端阀门，受重力作用样品溶液进入床面，最后用起始缓冲液加入柱内床面上2～3cm处，拧紧层析柱上口；(c)、洗脱：首先用起始缓冲液洗涤柱床，将起始条件下不能被吸附的物质从柱中洗去，在色谱图上形成穿透峰，洗涤过程需进行到峰后紫外吸收重新回到初始值附近为止，洗涤过程完成之后，开始进行梯度洗脱，洗脱液为pH7.2，50mmol/L磷酸缓冲液，NaCl浓度在0～0.5mol/L呈线性变化；(d)、样品收集：将洗脱出的溶液用蛋白质自动部分收集仪收集，收集体积为每管4ml，流速为1ml/min，将收集好的蛋白溶液进行超氧阴离子清除自由基能力检测，收集280nm峰和超氧阴离子自由基清除活性峰重叠区域，经透析除盐，冷冻干燥，备用；(e)、DEAE‑Sephadex A‑50的再生、清洗和储存：用高浓度NaCl溶液清洗色谱柱可以除去以离子键与交换剂结合的物质，当色谱柱上结合了以非离子键吸附的污染物，可在DEAE‑Sephadex A‑50清洗pH范围内进行碱酸交替清洗，在彻底清洗后可浸泡在含20％乙醇的0.2mol/L乙酸中于4～8℃保存；(3)、凝胶过滤层析：(a)、SephadexG‑75的预处理：SephadexG‑75干粉采用洗脱液浸泡，沸水浴3h，溶胀过程中不要过分搅拌，以防颗粒破碎，凝胶充分溶胀后用倾倒法将不易沉下的较细颗粒除去，将溶胀后凝胶抽干，用10倍体积的洗脱液处理约1h，搅拌后继续用倾倒法除去悬浮的较细颗粒；(b)、装柱：将层析柱垂直装好，关闭出口，加入洗脱液约1cm高，将处理好的凝胶用等体积洗脱液搅成浆状，自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中，待底部凝胶沉积约1～2cm高时，打开柱出口让水流出，同时不断缓慢加入凝胶悬液，高径比为48/1.6，体积为96.5ml；(c)、平衡：将洗脱液与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱入口相连，用2～3倍体积的洗脱液平衡，流速为0.5ml/min；(d)、加样与洗脱：将柱中多余的液体放出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口，将2ml样品(15mg/ml)，沿层析柱管壁小心加入，加完后打开层析底端出口，当样品液面降至与凝胶面相平时关闭层析柱出口，用少量洗脱液洗柱内壁2次，加洗脱液至液层4cm左右，接上恒流泵，调节好流速(0.5ml/min)，开始洗脱；(e)、收集与测定：用部分收集器收集洗脱液，每管2ml,紫外检测仪280nm处检测，绘制洗脱曲线，同时测定其超氧阴离子自由基清除活性大小，收集280nm峰和超氧阴离子自由基清除活性峰重叠区域，将收集液冷冻干燥，备用；(4)、超氧阴离子自由基(O2·—)清除能力测定：(a)、实验试剂的配制：A液(pH＝8.2，50mmol/L Tris‑HCl缓冲液，内含1mmol/L EDTA‑2Na)：量取2.1ml浓HCl，加蒸馏水定容到250ml，得到0.1mol/L HCl溶液；称取三羟甲基氨基甲烷3g，加蒸馏水溶解，再加入114.5ml0.1mol/L HCl溶液，用蒸馏水定容至500ml，制得pH8.2、浓度为50mmol/L的Tris‑HCl缓冲液液；B液(邻苯三酚溶液)：称取0.378g邻苯三酚，用0.01mol/L HCl溶液溶解定容至500ml，得浓度为3mmol/L的邻苯三酚溶液；(b)、邻苯三酚自氧化速率的测定取5.5mlA液于15ml的比色管中，混匀后在25℃水浴中保温20min，取出后立即加入在25℃水浴中预热过的B液，迅速摇匀后倒入比色皿，用紫外分光光度计在325nm下每隔30s测定一次吸光度，共反应5min，将自氧化速率控制在0.060～0.065A/min，将记录的数据以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，作直线回归得到的斜率表示邻苯三酚自氧化速率V₀，以A液为空白对照，记录结果；(c)、加入样品液后邻苯三酚自氧化速率的测定取(5.5‑x)ml A液，xml样品液于15ml的比色管中，混匀后在25℃水浴中保温20min，取出后立即加入在25℃水浴中预热过的B液，迅速摇匀后倒入比色皿，用紫外分光光度计在325nm下每隔30s测定一次吸光度，共反应5min，将记录的数据以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，作直线回归得到的斜率表示加入样品液后邻苯三酚自氧化速率V₁，以pH8.2Tris‑HCl缓冲液为空白对照，记录结果；(d)、计算抑制率$S(\%)==\frac{V_0-V_1}{V_0}\×100$式中：V₀为邻苯三酚自氧化时反应速率；V₁为加入样品液后邻苯三酚自氧化时反应速率；(5)、SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳：(a)、SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化的竹叶抗氧化肽的纯度；(b)、相对分子质量的计算：(1)、分别量出标准蛋白质、待测蛋白质区带中心距分离胶顶端的距离，按以下计算相对迁移率：相对迁移距离＝蛋白质分子迁移距离(cm)/染料迁移距离(cm)(2)、分析图谱，绘制标准曲线，以标准蛋白的相对分子质量的对数为纵坐标，相对迁移距离为横坐标作图，根据样品蛋白质分子的相对迁移距离，从标准曲线上查出其相对分子质量，log Mr＝K‑bX其中，Mr为分子量，X为相对迁移率，K、b均为常数；(6)、反相高效液相色谱：反相高效液相色谱的分离条件及参数：(a)、色谱柱填料0.5μm，C18为反相柱，尺寸为10mm×250mm；(b)、样品：将冷冻干燥的竹叶抗氧化肽用去离子水溶解，经0.45μm滤膜过滤，进样量20μl，流速1ml/min；(c)、流动A：去离子水，含0.1％三氟乙酸，经0.45μm滤膜过滤；(d)、流动B：纯乙腈，含0.1％三氟乙酸，经0.45μm滤膜过滤；(e)、洗脱条件：以流动相B体积分数为0％‑100％线性梯度变化作为洗脱液。