[发明专利]适合双向电泳的马尾松针叶蛋白质提取方法

摘要

本发明公开了一种适合双向电泳的马尾松针叶总蛋白质提取方法，首先将马尾松针叶蛋白质提取出来，然后采用双向电泳方法将蛋白质各成分和次生代谢物（如色素、酚类、醌类等）成分进行分离，最后采用考马斯亮蓝染色法进行定性分析和/或采用质谱仪对分离的蛋白质进行定性和定量分析。本发明采用的双向电泳分析方法分离得到的蛋白点多，经PDQuest图像分析软件检测，蛋白点多于1000个，且图谱清晰，无横向、纵向条纹，该方法重复性和稳定性好，是良好的适用于针叶类植物总蛋白提取的分析的方法。

主权项

适合双向电泳的马尾松针叶蛋白质提取方法，首先将马尾松针叶蛋白质提取出来，然后采用双向电泳方法将蛋白质各成分和次生代谢物成分进行分离，最后采用考马斯亮蓝染色法进行定性分析和/ 或采用质谱仪对分离的蛋白质进行定性和定量分析；其特征在于包括以下具体步骤：(1) 采集马尾松针叶，用超纯水洗净，并用滤纸吸去叶面水分，迅速放入液氮中速冻，并移至‑80℃冰箱保存备用；(2) 称取2g上述步骤保存的马尾松叶片迅速放入冰浴的研钵中，加液氮研磨成细粉，研磨过程中按1：2 质量体积比加入提取缓冲液、0.2g 聚乙烯吡咯烷酮，在冰浴下研磨成匀浆液；（3）研磨后的匀浆液装入50ml ‑20℃预冷离心管中，加入同体积的pH7.5Tris‑HCl饱和酚（酚提取蛋白），放入振荡器入振荡15‑30 min后，‑4℃低温离心机15000rpm离心15min ，取酚相；（4）步骤（3）酚相中加入3倍体积的醋酸铵（溶剂为甲醇），放入‑20℃冰箱沉淀过夜；（5）步骤（4）过夜物‑4℃低温离心机15000rpm离心15min，取沉淀；（6）洗涤步骤（5）沉淀三次，前一次用醋酸铵洗涤，后两次用冷丙酮（均在‑20℃冰箱预冷使用，含有质量体积比为0.07%的二硫苏糖醇（DTT）），每次洗完后，‑4℃低温离心机15000rpm离心15min，获得沉淀，将蛋白沉淀用真空离心浓缩干燥仪真空冷冻干燥，得到马尾松针叶全蛋白粉末，备用；（7）步骤（6）蛋白干粉在4℃按每mg蛋白400μL裂解液的质量体积比加入裂解液裂解样品，裂解液溶解的样品放于冰浴上超声助溶后10分钟，‑4℃下15000 rpm离心30 min去除沉淀，得到蛋白质提取液，取上清测量样品蛋白浓度；采用考马斯亮兰法（Bradford）测定其蛋白浓度，对蛋白质进行定量； (8) 取步骤(7) 得到的蛋白质提取液进行第一向等电聚焦电泳：按上样量500μg，上样体积450μl，用水化液对已定量好的蛋白样品进行稀释；将蛋白样品加入水化盘内后，再将线性IPG 胶条（选pH 4‑7，17cm，GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA）胶面向下放入水化盘中，除去胶面与蛋白样品液间的气泡，每个胶条用10ml 矿物油覆盖胶条，进行水化；水化结束后进行等电聚焦； (9) 胶条平衡处理：将步骤(8) 等电聚焦完成后的IPG 胶条进行平衡2 次，第一次胶条平衡缓冲液为：每1ml 胶条平衡缓冲液母液加入10mg 二硫苏糖醇(DTT) ；第二次胶条平衡缓冲液为：每1ml 胶条平衡缓冲液母液加入25mg 碘乙酰胺；每次平衡时间为15min；（10）第二向聚丙烯酰胺凝胶(SDS‑PAGE) 电泳：将平衡好的胶条转移到第二向垂直板胶（15%分离胶，4%浓缩胶）的上端；用0.5%的低熔点琼脂糖密封，加入电极缓冲液（含0.001%溴酚蓝显色剂）进行SDS－PAGE凝胶电泳，恒定电流20mA/gel，待溴酚蓝至胶底端关闭电源；（11）电泳结束后对胶条采用考马斯亮蓝（CBB R‑250）染色法进行染色分析或对蛋白质进行质谱检测：电泳完成后，取下凝胶，置于固定液中进行固定，时间为30 min；固定好的凝胶置于CBB R‑250染色液中，室温下染色3小时以上；倒出染色液，加入脱色液进行脱色；15分钟后更换脱色液，继续脱色3小时左右，其间更换数次脱色液，至凝胶背景合适，蛋白点鲜明为止；固定、染色以及脱色过程均在脱色摇床上晃动进行。