[发明专利]共表达摄取转运体和药物代谢酶模型的构建及应用

摘要

本发明提供一种共表达摄取转运体和药物代谢酶模型的构建，以人基因OAT1cDNA为模板，扩增获得人OAT1基因片段，连接到载体pcDNA3.1(+)，获得质粒pcDNA3.1(+)/OAT1，转染MDCK细胞，经筛选得到高表达OAT1的MDCK-hOAT1细胞；然后将人CYP1A2基因片度连接到载体pcDNA3.1/Hygro(+)，获得质粒pcDNA3.1/Hygro(+)/CYP1A2，转染MDCK-hOAT1细胞，经潮霉素B筛选，得到共表达OAT1和CYP1A2细胞，再对细胞进行mRNA验证并通过经典底物及抑制剂进行功能验证。本发明的细胞模型可在基于OAT1和CYP1A2的药物毒性作用在细胞水平上筛选中的应用，可预测这两种蛋白对药物处置过程中的协同作用，为临床合理用药提供依据。本发明设计合理，重复性强。

主权项

一种共表达摄取转运体和药物代谢酶细胞模型的构建方法，其特征在于，通过以下步骤实现：（1）以人基因OAT1 cDNA为模板，通过设计含EcoR I和NheI双酶切位点的特定引物SEQ ID No:3和SEQ ID No:4，扩增得到人OAT1基因片段NM_004790，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，经过双酶切的PCR产物和载体pcDNA3.1(+)片段，通过T4连接酶连接，构建质粒pcDNA3.1(+)/OAT1，转化大肠杆菌进行质粒扩增，测序；测序正确后，转染MDCK细胞，经过氨基糖苷类抗生素G418筛选出单克隆细胞，得到稳定高表达OAT1的MDCK细胞；（2）然后从冰冻人肝组织中提取总RNA，经逆转录获得人的cDNA文库，以该cDNA为模板，通过设计含有BamH I和Nhe I两个酶切位点的特定引物SEQ ID No:5和 SEQ ID No:6，扩增得到人CYP1A2基因片段NM_000761,其核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；（3）经过双酶切的PCR产物和带有潮霉素B筛选标记的载体pcDNA3.1/Hygro(+)片段，通过T4连接酶连接，构建质粒pcDNA3.1/Hygro(+)/CYP1A2，转化大肠杆菌进行质粒扩增，测序；（4）测序正确后，转染MDCK‑hOAT1细胞，经过潮霉素B筛选，得到共表达OAT1和CYP1A2细胞，进行mRNA验证并通过经典底物对氨基马尿酸及抑制剂丙磺舒进行OAT1的功能验证以及通过经典底物非那西丁进行CYP1A2的功能验证。