[发明专利]一种多聚体荧光蛋白复合物及其应用

摘要

本发明公开了一种多聚体荧光蛋白复合物及其应用。该多聚体荧光蛋白复合物，由多聚体荧光蛋白和目的蛋白连接而成；所述多聚体荧光蛋白由若干个荧光蛋白单体组成；所述目的蛋白是能够与靶标蛋白相互作用的蛋白。蛋白复合物保留了单区抗体的抗原识别特异性，并能染色表达该抗原的细胞。单区抗体和DsRed能在体外被耦合连接，连接产物在没有其他标记试剂的情况下，能直接用于一步染色，在FACS及其他领域有较强的应用价值。

主权项

1.一种制备多聚体荧光蛋白复合物的方法，包括如下步骤：Ⅰ、制备A片段，A片段为N端连接有2‑7个甘氨酸的、可形成多聚体的荧光蛋白单体；Ⅱ、制备B片段，B片段为C端连接有转肽酶的识别序列的、具有识别功能的蛋白；Ⅲ、使A片段和B片段在转肽酶的作用下进行连接，得到所述荧光蛋白单体与所述具有识别功能的蛋白的复合物；所述荧光蛋白单体与具有识别功能的蛋白的复合物为如下中的至少一种：由所述荧光蛋白单体组成的多聚体，该多聚体中有1个、2个、……、n个荧光蛋白单体均分别与一个所述具有识别功能的蛋白形成融合蛋白；所述n小于等于构成所述多聚体的荧光蛋白单体的数目；所述使A片段和B片段在转肽酶的作用下进行连接的方法为：制备含有A片段、B片段和转肽酶的反应体系，将整个反应体系进行孵育；所述含有A片段、B片段和转肽酶的反应体系由所述A片段、所述B片段、所述转肽酶、氯化钠、氯化钙和Tris‑HCl缓冲液组成；所述转肽酶的识别序列为LPETG；所述转肽酶为编码基因序列为SEQ ID No.1所示的蛋白；所述融合蛋白从N端至C端的序列为：具有识别功能的蛋白‑LPETGGG‑可形成多聚体的荧光蛋白单体；所述A片段按照如下方法制备：将从N端至C端序列为转肽酶‑LPETGGG的融合蛋白的编码基因插入带有His标签的重组表达质粒中，得到重组表达载体p‑His‑转肽酶‑LPETGGG；将荧光蛋白单体的编码基因插在重组表达载体p‑His‑转肽酶‑LPETGGG中LPETGGG的下游，得到重组表达载体p‑His‑转肽酶‑LPETGGG‑荧光蛋白单体；将重组表达载体p‑His‑转肽酶‑LPETGGG‑荧光蛋白单体导入大肠杆菌中，进行原核表达，纯化，得到从N端至C端序列为His‑转肽酶‑LPETGGG‑荧光蛋白单体的融合蛋白；将从N端至C端序列为His‑转肽酶‑LPETGGG‑荧光蛋白单体的融合蛋白用Tris‑HCl缓冲液和氯化钙的混合溶液室温孵育，使得His‑转肽酶‑LPETGGG‑荧光蛋白单体的融合蛋白断裂为序列为His‑转肽酶‑LPET的融合蛋白和序列为GGG‑荧光蛋白单体的融合蛋白；用His标记蛋白纯化柱进行纯化，收集不带有His标签的物质，即得到从N端至C端序列为GGG‑荧光蛋白单体的融合蛋白；所述B片段按照如下方法制备：将从N端至C端序列为具有识别功能的蛋白‑LPETG的融合蛋白的编码基因插入带有His标签的重组表达质粒中，得到重组表达载体p‑具有识别功能的蛋白‑ LPETG‑ His；将p‑具有识别功能的蛋白‑ LPETG‑ His导入大肠杆菌中，进行原核表达，纯化，得到从N端至C端序列为具有识别功能的蛋白‑LPETG ‑His标签的融合蛋白；所述步骤Ⅲ中，整个反应体系孵育完毕后，还包括如下步骤：用His标记蛋白纯化柱进行纯化，收集不带有His标签的物质，即为所述复合物和所述荧光蛋白单体的混合物；再进行蛋白凝胶电泳纯化，即得所述复合物；所述可形成多聚体的荧光蛋白单体为DsRed；所述具有识别功能的蛋白为单区抗体；所述单区抗体为GPA7。