[发明专利]一种人降钙素原免疫检测试剂盒及其制备方法与应用

摘要

本发明提供了一种人降钙素原免疫检测试剂盒，试剂盒内包括PCT单克隆多抗包被的酶标板；至少两个PCT标准品试剂瓶，每个PCT标准品试剂瓶中装有不同浓度的PCT标准品；酶标试剂瓶，其中装有酶标记的抗PCT的单克隆多抗。本发明的检测试剂盒具有较好的敏感性和特异性，结果与参比试剂符合率高，能提供更准确可靠的检验结果，所述试剂盒操作简便易行，检测快速灵敏，所用酶标仪简单、普及，价格低廉，该检测试剂盒为人降钙素原检测提供了一种有效工具。

主权项

一种人降钙素原免疫检测试剂盒，其特征在于试剂盒内包括PCT单克隆多抗包被的酶标板；至少两个PCT标准品试剂瓶，每个PCT标准品试剂瓶中装有不同浓度的PCT标准品；酶标试剂瓶，其中装有酶标记的抗PCT的单克隆多抗；所述抗PCT单克隆多抗为针对PCT抗原的N端、降钙素或下钙素中的多种肽段表位的多克隆抗体的混合物，用PCT抗原片段做为免疫原，经免疫动物、分离和纯化抗血清得到；所述的PCT抗原片段为PCT抗原的N端、降钙素、下钙素；所述PCT抗原片段通过下述步骤制备得到：(1)取1份PCT全长抗原；(2)配置2份酶解液：Prohormone Convertase、Carboxypeptidase、Aminopeptidase、Pepeitdyl Glycine Amidating Mono‑oxygenase各30IU/g，溶解在2份20mM Tris，500mM NaCl，pH7.4或者PBS缓冲液中，pH7.4；(3)加入酶解液，37℃水浴酶解2h～4h；(4)将分别针对N端、降钙素以及下钙素抗原的三种单克隆抗体单独偶联到层析柱上，将酶解液依次过滤进行亲和纯化，从而获得N端、降钙素以及下钙素三种抗原，具体步骤如下：a将上述抗体分别结合到蛋白A或蛋白G微珠上，每份湿的微珠结合2份单克隆抗体，将抗体和蛋白A或蛋白G微珠混合制成匀浆，在总量为10份的溶液中加入1份微珠，室温孵育1h，混匀；b用10倍体积的0.2mol/L硼酸钠，pH9.0洗涤微珠2次，每次以3000g离心2min或10,000g离心30s；c用10倍体积的0.2mol/L硼酸钠，pH9.0重悬微珠，留样，加入足量的二甲基庚二酸酯固体至微珠匀浆中，使终浓度为20mmol/L；d室温孵育30min，并混匀，留样；e用0.2mol/L乙醇胺，pH8.0洗涤微珠1次以终止反应，然后重悬于0.2mol/L乙醇胺，室温孵育2h，混匀；f将抗体包被的微珠转入层析柱中，用PBS缓冲液，pH7.4冲洗容器；g用20倍柱床体积与制备抗原相同的缓冲液洗柱；h将抗原液加到柱上，按每毫升柱体积1mL/h的速度使抗原溶液流过层析柱；i用20倍柱床体积的结合缓冲液洗柱；k采用分段洗脱法，连续以0.5倍柱床体积的洗脱缓冲液通过层析柱，分管收集每一组分份；l检测每管的抗原含量，将浓度高的各管合并。