[发明专利]一种人降钙素原免疫检测试剂盒及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及人降钙素原的检测方法，尤其涉及vde免疫检测试剂盒，属于生物领域。

背景技术

降钙素原(procalcitonin,PCT)是无激素活性的降钙素前肽物质，分子质量为13kD的糖蛋白，由116个氨基酸组成，包括N-残端、降钙素、下钙素三个部分，其中1～57为N-残端，60～92为降钙素，96～116为下钙素。1996年以来，PCT作为一种新型的诊断细菌感染以及其继发的合并症的鉴别诊断工具，在诊断败血症、败血症休克以及严重系统炎症反应等此类疾病诊断以及过程的追踪观察方面，PCT诊断具有明显优势，且特异性高。2001年国际脓毒症会议的脓毒症诊断标准已把PCT作为诊断指标之一。近年来PCT被认为是系统性炎性反应综合征、脓毒症、急性呼吸窘迫综合征等疾病的预警指标，反映了全身性细菌感染的存在和严重程度。

在人体血液循环中，不仅存在全长的PCT多肽(约13kD)，而且源自于PCT多肽的片段也广泛存在其中，具体来说，相关文献也讨论过降钙素部分上下游分别发生的蛋白水解切割(Muller等，Crit Care Med 2000；977-83；Whang等，J Clin Endocrinol Metab 1998；83:3296-301)。然而，关于此的实验证据很少，使用针对PCT的降钙素部分的抗体通过亲和层析从脓毒症患者分离到循环中的PCT，并且已经得出结论，即PCT3-116是主要的循环PCT物质(Weglohner等，Peptides 2001；22:2099-103.)。目前可以确定的是，甲状腺的C细胞首先合成前PCT，前降钙素原主要由N端84个氨基酸(含由25个氨基酸的前导肽)、活性降钙素(32肽)和Katacalcin(21肽)三部分组成，后两部分被4肽(-Gys-Lys-Lys-Arg-)隔开。前降钙素原进入内质网，经糖基化和酶切除导肽，转变为PCT，PCT又经不同蛋白酶分别作用，先切除N端肽形成57肽，57肽进一步降解即生成成熟降钙素和Katacalcin，成熟降钙素的C末端尚需酰胺化才能最后形成活性降钙素，降钙素为活性32肽。

实验证明，PCT浓度升高的主要原因是细菌内毒素引发的全身效应。PCT在检测时表现出的高度特异性的原因是：1、在正常个体中，PCT经过一系列的体内酶催化作用最后水解形成CT，故其血清中的PCT浓度很低，仅为10～50pg/ml。2、在系统炎症反应综合症(SIRS)、败血症、急性/慢性肺炎、急性胰腺炎、活动性肝炎和创伤等患者的血清中的PCT浓度会显著升高，其浓度可达到正常水平的几倍甚至上万倍。研究表明，在LPS血类败血症相关因子作用下，靶细胞(PBMC)等应急分泌PCT，这时PCT的分泌速率超过转化速率(由PCT分解成CT)，或者该转换过程缺少相关的水解酶，从而导致血清中PCT浓度成倍升高。3、在病毒感染、慢性非特异性炎症等患者的血清中PCT浓度持平或稍有增加。因此，PCT可作为判断病情与预后以及疗效观察的可靠指标，它不仅与疾病的严重程度成正相关，而且随着病情的变化而变化。

目前国际上开展的PCT浓度检测方法很多，主要有以下几类：

(1)凝胶法，此方法费事且不易形成自动化检测；

(2)酶联免疫吸附法，传统的ELISA法检测操作复杂、反应时间较长、灵敏度低；

(3)放射免疫测定，此方法反应时间长、检测结果不稳定，重复性差，且存在放射性污染问题；

(4)免疫发光法，该方法特异性强、灵敏度高，但需要昂贵的实验仪器；

(5)胶体金层析法，此方法灵敏度低，只能定性无法实验定量检测；

在PCT的临床检测中，目前国际市场上免疫检测产品包括法国梅里埃VIDAS，美国RB公司,美国RD公司等均有推出，VIDAS采用荧光法检测，需要特定的仪器，才能够实现准确定量；ELISA产品采用双抗夹心法，先将PCT的特异抗体包被在酶标板上，再加入待检样本37℃孵育，再加入辣根过氧化物酶(即HRP)标记的单克隆抗体37℃孵育，待检样本中的抗原会与特异单克隆抗体结合并形成夹心结构，再加入四甲基联苯胺显色，颜色的深浅和待检抗原的浓度呈正相关，从而实现PCT的检测。此类产品在检测时采用两步法，检测速度慢导致检测耗时过长，检测的准确度也存在不足之处；并且此类方法通常采用PCT单抗或多抗，检测敏感性不足，在较低浓度下往往无法建立线性良好的标准曲线，导致其无法检测较低浓度的PCT待测样品。

发明内容

在本发明的全文中，下述简写分别代表的术语是：

PCT-人降钙素原；

PBS-磷酸盐缓冲溶液；