[发明专利]一种从短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的方法

摘要

本发明是一种从短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的方法，该方法通过发酵生产制得发酵菌液；离心制得上清液；然后用硫酸铵沉淀，所得沉淀用缓冲液重悬，得重悬液；通过离子交换法分离，收集洗脱峰、浓缩、透析，得活性成分分离峰。再通过抗菌活性检测和蛋白质电泳检测，测得短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的分子量在在97.2-116.0kD之间。本发明方法设计简单合理，操作方便，通过本发明方法可以分离得到具有抗哈维氏弧菌（Vibrioharveyi）效果的蛋白质。

主权项

一种从短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的方法，其特征在于，其步骤如下：（1）发酵生产：取培养过夜的短小芽孢杆菌E14（Bacillus  pumilus）将短小芽孢杆菌E14种子菌液接种于2216E液体培养基中，接种量为5%，180rpm，28℃培养24h；得发酵菌液；（2）上清液制备：发酵菌液1200rpm，4℃离心30min，上清液再次离心，重复2‑3次；得上清液；（3）硫酸铵沉淀：将硫酸铵烘干磨细，依据饱和硫酸铵溶液配制表，分别称取不同等份，冰上边搅拌边加入上清液中，获得质量体积百分比为40%的硫酸铵溶液，然后冰上静置20 min，4℃，8000rpm离心5 min；取上清，继续冰上边搅拌边加入硫酸铵，至质量体积百分比为80%的硫酸铵溶液，冰上静置20 min，4℃，8000rpm离心30 min，沉淀用缓冲液重悬，重悬体积为沉淀前上清液的1/10，得重悬液；缓冲液为50 mmoL Tris‑HCl pH 8.0，含150 mmoL NaCl，50 mmoL EDTA；（4）离子交换法分离：采用DEAE Sepharose Fast Flow即DEAE FF分离；装柱：根据柱子大小，取适量的DEAE FF，加入适量的buffer A即50 mmoL Tris‑HCl pH 8.0，用玻璃棒轻轻搅拌，将其引流到层析柱中； 平衡柱子：在Biologic Duoflow FPLC蛋白质层析系统上操作，buffer A平衡10倍柱体积，流速1.0 mL/min；上样与洗脱：在Biologic Duoflow FPLC蛋白质层析系统中设置程序，完全自动进行，全程流速1.0 mL/min，当A₂₈₀ 大于0.05时开始收集，每管收集1.5 mL，程序如下： V为柱体积：buffer A再平衡5×V；重悬液上样80 mL；buffer A平衡5×V；buffer B即50 mmoL Tris‑HCl pH 8.0，0.8 mol/L NaCl，由0 % ‑ 100 % 梯度洗脱10×V；buffer B洗脱5×V；buffer A洗脱5×V；（5）收集、浓缩、透析：将洗脱峰收集，同一峰的各试管合并，‑70 ℃冰箱预冷过夜，用LG‑5冷冻干燥机浓缩；冻干样品用适量buffer C溶解，移至截留分子量为30 kD的透析袋中，并用buffer C透析6 h，中间换透析液一次，得活性成分分离峰；buffer C为50 mmol Tris‑Cl pH8.0，含50 mmol NaCl，0.5 mmol EDTA；（6）抗菌活性检测：抑菌活性检测采用滤纸片抑菌圈法： 将过夜培养的病原菌哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）3μL均匀涂抹于2216E固体培养基平板上，待培养基表面稍干后，将直径为6 mm的无菌滤纸片放置于培养皿中，然后吸取50 μL活性成分分离峰分次滴加于滤纸片上，28℃培养，16 h后观察抑菌圈，测量抑菌圈大小；（7）蛋白质电泳检测；对具有抗菌活性的活性成分分离峰进行SDS‑PAGE电泳检测，按常规SDS‑PAGA技术规程操作，测得短小芽孢杆菌E14中分离抗菌蛋白质的分子量在在97.2‑116.0 kD之间。