[发明专利]降低牛、羊精液中畸形精子比率和死精子比率的方法

摘要

一种降低牛、羊精液中畸形精子比率和死精子比率的方法，用NaHCO3、Hepes、MgCl2、NaLactate、KCl、Glucose、NaCl、Na2HPO4、NaPyruvate和0.3%BSA配置Staining Talp稀释液，将StainingTalp稀释液预热至37℃后置于容器内。将活力区间为40%-60%的新鲜精液注入到StainingTalp稀释液底部，37℃温浴，正常活精子向上游动后处在稀释液上层，吸取上层并3000rpm/min离心收集精子。本发明的有益效果是：通过上游法处理后的牛、羊精液，畸形精子和死精子比率显著降低，可以提高X/Y精子分离效率、提高精子活力、提高受精受胎率。

主权项

一种降低牛、羊精液中畸形精子比率和死精子比率的方法，其特征在于：它包括如下步骤：(一)、Staining  Talp稀释液的配置：NaHCO3                                         10mmol/L，        Hepes                     40mmol/L，MgCl2                                           0.4mmol/L，NaLactate                 25mmol/L，KCl                       3mmol/L，Glucose                   5mmol/L，NaCl                      95mmol/L，Na2HPO4                                        0.3mmol/L，NaPyruvate                2mmol/L，0.3%BSA                   3g/L；以上成分依次溶解入超纯水中，最终体积定容至1L；（二）、Staining  Talp稀释液的保存：          Staining  Talp稀释液保存在4℃，保存期限为两周；（三）、上游法处理新鲜精液：（1）提前37℃预热容器，再将4ml Staining  Talp稀释液预热至37℃后，置于容器内；（2）选取活力区间为40%‑60%的新鲜精液，取1ml注入容器内Staining  Talp稀释液的底部，37℃温浴30分钟；（3）吸出顶部4ml精液，将吸出的4ml精液3000rpm/min离心5分钟，弃掉3 ml上清液，保留底部1ml精液； （四）、精液各项指标检测：（1）精子活力检测：预先把载玻片和盖玻片放在37℃加热板上预热10分钟，用移液器离心管从步骤（三）（3）的底部1ml精液中取15µl样品，滴在准备好的载玻片上，压片后置于显微镜下镜检，选择压片均匀的样品区域观察，一个压片取5个视野，中间1个，四周各取1个，分别计数活精子数和死精子数，并计算活力；精子活力=活精子数/活精子数与死精子数的和；（2）畸形率检测：A、从步骤（三）（3）的底部1ml精液中取一滴精液滴于载玻片一端，用另一边缘光滑的载玻片与有样品的载玻片成35°夹角，将样品均匀地涂抹于载玻片上，自然风干约5 min，每样品制作2个抹片；B、在已风干的抹片上滴上1.0 mL～2.0 mL0.05%福尔马林，pH值为6.5‑7.5，固定15 min后用清水缓缓冲去福尔马林，吹干或自然风干；C、将固定好后的抹片反扣在带有平槽的有机玻璃面上，把姬姆萨染液滴于槽和抹片之间，让其充满平槽并使抹片接触染液，染色1.5 h后用清水缓缓冲去染液，晾干待检；D、镜检：将步骤C中晾干待检的抹片置于400倍～600倍显微镜下观察，每个抹片观察200个以上的精子，分左、右二个区，取2片的平均值，2片的变异系数不得大于20%，若超过应重新制片；畸形率=畸形精子数/总精子数；（3）精子总数：从步骤（三）（3）的底部1ml精液中取精液50ul，用950ul的0.05%福尔马林溶液将精液稀释20倍，再进行20倍稀释，用血球计数板计数，在显微镜调至自然光下，计数精子浓度。