[发明专利]一种虎杖发酵液中白藜芦醇的提取方法

摘要

种虎杖发酵液中白藜芦醇的提取方法，包括以下步骤：（1）内生真菌L1孢子悬浮液制备；（2）培养基准备；（3）发酵，得虎杖发酵液；（4）提取：用乙酸乙酯分四次萃取虎杖发酵液，合并乙酸乙酯相，浓缩至干，得白藜芦醇粗提取物；（5）大孔树脂－硅胶联合层析；（6）精制，得白藜芦醇产品。本发明工艺简单，生产成本低，对环境污染小，适宜工业化生产。利用本发明对虎杖发酵液进行提纯分离，纯化后的白藜芦醇纯度可达92wt％。

主权项

一种虎杖发酵液中白藜芦醇的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）内生真菌L1孢子悬浮液制备：从内生真菌L1　PDA斜面上挑五环菌体于10ml生理盐水中，充分震荡；所述内生真菌L1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.4558；（2）培养基准备：将新鲜虎杖粉碎至180目，按质量比虎杖1.5wt%、无水乙醇 2 wt%、 CMC‑Na 2.5 wt%、 NH4NO3 0.2 wt%、Na2HP040.06 wt%、 CaCl20.1 wt%配制发酵培养基；调起始pH值为5.5；（3）发酵：先将步骤（2）中的培养基经121℃、30min湿热灭菌；再将3ml的内生真菌L1孢子悬浮液接入250ml三角瓶中，所述三角瓶中装有30mL起始pH 5.5的培养基，再在培养条件为温度 28℃、转速 220r/min下,发酵60h，得虎杖发酵液；（4）提取：用乙酸乙酯分四次萃取虎杖发酵液，合并乙酸乙酯相，浓缩至干，得白藜芦醇粗提取物；（5）大孔树脂－硅胶联合层析：将步骤（4）所得白藜芦醇粗提取物溶于乙醇与乙酸乙酯的混合液，所述乙醇与乙酸乙酯的混合液中，乙醇与乙酸乙酯的体积比为2:3；然后用滤纸过滤，弃去滤渣，得滤液；往大孔树脂柱加去离子水，当去离子水液面与大孔树脂柱顶部表面齐平时，将所得滤液加到大孔树脂柱顶部，当滤液液面没过大孔树脂柱顶部时，用乙醇与乙酸乙酯体积比为2:3的混合液作为洗脱液进行洗脱，大孔树脂层析洗脱速度为lml／mim，收集洗脱液；再将收集的洗脱液即大孔树脂层析后的白藜芦醇混合液，加入到硅胶层析柱中，待白藜芦醇混合液渗入硅胶中，再用乙醇:乙酸乙酯体积比为4:1的乙醇与乙酸乙酯的混合液作为硅胶柱用洗脱液进行洗脱，硅胶层析洗脱速度为lml／mim，得洗脱液；（6）精制：将步骤（5）所得洗脱液，减压浓缩，至刚好有沉淀出现，溶液变混浊时，停止浓缩，将浓缩液在4℃条件下静置24h以上析晶，得到黄色晶体，经冷冻干燥，得白藜芦醇产品。