[发明专利]一种低分子肝素完全降解产物结合柱前衍生的反相色谱质谱联用检测方法

摘要

发明涉及一种低分子肝素完全降解产物结合柱前衍生的反相色谱与高分辨质谱联用检测方法。它利用反相色谱与高分辨质谱进行联用检测低分子肝素完全降解产物的各个组分，通过反相色谱分离样品中各组分，并通过高分辨质谱获得精确的分子量，检测除8种常见肝素二糖以外的末端修饰结构和特殊结构例如与抗凝血相关的3-O-硫酸四糖和由剥离反应得到的三糖，从而对各低分子肝素完全降解产物的结构进行比较精细的表征。本发明解决了现有技术中仅能检测8种常见肝素二糖的问题，对于低分子肝素仿制药的研发、生产控制和保障药品安全具有极大的实用价值。

主权项

一种低分子肝素完全降解产物结合柱前衍生的反相色谱质谱联用检测方法，步骤如下：（1）将醋酸铵试剂溶解于去离子水，并将pH调至3～6，制得醋酸铵浓度为20～80mM的流动相A；（2）甲醇作为流动相B；（3）向10～50μg含有内标的低分子肝素完全酶解样品中加入5～10μL浓度为0.1M的2‑氨基吖啶酮（AMAC）溶液中，室温放置10～20min，然后再加入5～10μL浓度为1M的氰基硼氢化钠（NaBH3CN）溶液，45℃孵育2～4h，制得衍生后的样品；（4）将步骤（3）制得的衍生后的样品用质量浓度为50%的二甲基亚砜（DMSO）溶液稀释成衍生后的样品浓度为1～5μg/μL的待测溶液，经离心后，使用C18反相色谱柱进行分离；流速0.5～1mL/min，洗脱梯度如下，均为体积百分比：0～55min，80～98%流动相A，2～20%流动相B；55～100min，80%流动相A，20%流动相B；100～120min，50～80%流动相A，20～50%流动相B；（5）在正离子模式或负离子模式下用高分辨质谱仪进行检测，得到高分辨质谱图；所述步骤（5）中的高分辨质谱采用离子阱时间飞行串联质谱仪（IT‑TOF），设定参数为：正离子模式喷雾电压：+3.6kV；负离子模式喷雾电压：‑3.5kV；喷雾气流速：0.5L/min或者1.5L/min；扫描质量范围：100～1000。