[发明专利]一种哺乳动物肌内脂肪细胞和骨骼肌细胞分层共培养方法

摘要

本发明公开了一种哺乳动物肌内脂肪细胞和骨骼肌细胞分层共培养方法。采取屠宰后动物背最长肌组织，冲洗剪碎后Ⅰ型胶原酶消化，消化后的混和液过筛；收集滤液，离心，分别收集上层成熟脂肪细胞液和下层肌细胞，分别加适量无血清培养基稀释洗涤，离心；取上层离心液和下层肌细胞液加入25cm²培养瓶中，在37℃、5%CO₂培养箱中培养。成熟脂肪细胞由于浮力小将漂浮贴壁到上层“天花板”面，而肌细胞下沉到培养瓶底面生长。该细胞培养模型可以将动物同一肌肉组织的肌内脂肪细胞和肌细胞在同一培养液中分层并共培养，从而为研究成熟脂肪细胞分泌物对肌细胞分化的影响或肌细胞和脂肪细胞的相互作用提供新的体外细胞研究模型。

主权项

一种哺乳动物肌内脂肪细胞和骨骼肌细胞分层共培养方法，其特征在于包括以下步骤：1）取动物背最长肌，肌内脂肪丰富的肌肉样组织，除去可见的血管和结缔组织，用PBS缓冲液冲洗；2）在无菌条件下将组织剪成小块，加入浓度为1g/LⅠ型胶原酶消化液消化；3）消化结束后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基等体积中和消化液，用孔径为250μm的尼龙网筛过滤细胞悬液；4）步骤3）的滤液经900～1200r/m离心8～15min，取离心后的顶层悬浮成熟脂肪细胞液加入25cm²培养瓶中，在37℃、5％CO₂培养箱中静置培养；所述的25cm²培养瓶需预先灌满含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，在37℃、5％CO₂培养箱中静置孵育4～6小时，使培养瓶内保持均衡；5）取上一步离心的下层细胞加红细胞裂解液洗涤，轻轻吹打以裂解红细胞，作用3～8min后900～1200r/m离心3～8min；倒掉上层离心液，加无血清DMEM/F12培养基稀释洗涤下层细胞，再用孔径为80μm的尼龙网筛过滤，收集滤液，1000r/min离心5min；倒掉上层离心液，加入500μL含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，吹打分散细胞后接种于装有含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基的直径为3.5cm培养皿中,置含37℃、5％CO₂培养箱中静置培养；6）接种后2～3小时，取出细胞培养皿，轻轻吹打培养皿的底部,吸出含肌细胞的培养液,转移到步骤入4）中的25cm²培养瓶中，在37℃、5％CO₂培养箱中培养细胞；7）成熟脂肪细胞由于浮力小将漂浮贴壁到“天花板”面，而骨骼肌细胞会下沉到瓶底生长，从而24小时后就能够实现在同一培养瓶中获得来自同一动物同一组织的分层共培养的骨骼肌细胞和肌内脂肪细胞。