[发明专利]一种从人羊膜中制取干细胞的方法

摘要

本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法，具体指一种羊膜中分离上皮细胞和间充质干细胞方法，涉及细胞分离技术领域。通过自制的无菌、高效、稳定的胎盘保护液对胎盘进行采集，利用消化法和爬片法的组合，将羊膜上皮细胞与羊膜间充质干细胞分离开来，分别得到高纯度的羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞。本发明解决了现有技术中存在人羊膜采集污染率高、采集后的细胞活性差，直接影响了后续的细胞分离及培养的问题。是对从人羊膜中分离干细胞的方法进行改良和创新，形成了一套标准化的分离方案，能够更稳定，充分利用羊膜的干细胞资源，无污染，纯度高，细胞数量更多，在保持细胞活性的同时，保证了干细胞的原始特性。

主权项

一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其特征在于，包括采集，分离，培养，冻存，检测；其中，分离过程中，羊膜上皮细胞采用酶消化法，继而羊膜间充质干细胞采用组织爬片法，两者分步连续完成；所述采集包括：将采集的胎盘，放入含有0.2克/升链霉素和0.12克/升青霉素的D‑Hanks液胎盘保护液的无菌袋内，将无菌袋进行密封并放入采集盒，将采集盒放入恒温采集箱，在24小时内将恒温采集箱送至干细胞库，所述恒温采集箱具体温度为2℃～8℃；所述羊膜上皮细胞的分离方法包括：将胎盘平铺在面积为400cm²圆盘内，用生理盐水将血丝冲洗干净；用手术剪剪取整个正面的羊膜；将羊膜放入面积为200cm²的圆盘中，使之铺展开，用止血钳除去羊膜上的血丝后，放入烧杯中，用生理盐水冲洗5~6次，每次使用100毫升~150毫升生理盐水；之后通过酶消化法对羊膜进行处理，所述酶消化法具体包括：将经生理盐水冲洗后的羊膜放入第一血浆瓶中，向其中加入浓度为2.5克/升的胰蛋白酶30毫升；37℃恒温静止消化，使整块羊膜完全与胰蛋白酶充分接触后，经37℃恒温静止消化8分钟~12分钟；将羊膜取出，弃消化液，将羊膜置于第二血浆瓶中，加入浓度为2.5克/升的胰蛋白酶30毫升，使整块羊膜完全与胰蛋白酶液充分接触后，经37℃恒温静止消化10分钟~20分钟；消化结束后，用药勺在第二血浆瓶中将羊膜均匀搅拌0.5分钟~2分钟至消化液变为乳白色浑浊液体，再向其中加入2毫升胎牛血清终止消化；用止血钳夹起羊膜，用100毫升生理盐水冲洗一遍后，收集消化液和冲洗液，并用100目细胞筛过滤；将所得细胞悬液进行细胞计数，取50微升细胞悬液与50微升0.4%台盼蓝混匀后，用移液器打入血球计数板中，静置1分钟后，显微镜下观察计数；过滤后的液体分装于50毫升离心管中，经300G~800G离心机工作5分钟；将离心所得细胞用含5%胎牛血清和0.01毫克/升bFGF的DMEM/F12培养液15毫升吹打混匀后接种于第一个培养瓶中进行培养，或使用DMSO加胎牛血清直接冻存；所述羊膜间充质干细胞的分离方法包括：其中一，采用整块组织爬片法，将消化剩余的羊膜放入第一烧杯中，用50毫升生理盐水反复冲洗3次，冲洗后的羊膜置于第二烧杯中晾干；培养：将整块羊膜铺展在T75培养瓶中，若羊膜块面积大于培养瓶底面积，将羊膜块剪成2‑3大块，分别铺展在另外培养瓶中，经37℃培养箱中恒温放置3小时后，缓慢加入5毫升的DMEM/F12含10%胎牛血清和0.01毫克/升EGF培养液将羊膜块组织润湿培养；6天后，全量换液，待细胞爬出至细胞长满培养瓶底面积的30%及以上后，进行传代操作，传代后细胞可进行冻存或用于实验研究；其中二，采用碎块组织爬片法，将消化剩余的羊膜放入第一烧杯中，用50毫升生理盐水反复冲洗3次，冲洗后的羊膜置于第二烧杯中用手术剪将其剪碎至1毫米3的小块；培养：用药勺将剪好的羊膜块均匀地铺展在T75培养瓶中，羊膜块中间的间隔在0.2cm，每个T75培养瓶接种200块羊膜组织，经37℃培养箱中恒温放置3小时后，缓慢加入10毫升的DMEM/F12，DMEM/F12含10%胎牛血清和0.01毫克/升EGF培养液将所有羊膜组织润湿培养；6天后，全量换液，待细胞爬出至细胞长满培养瓶底面积的30%及以上后，进行传代操作，传代后细胞可进行冻存或用于实验研究。