[发明专利]一种从人羊膜中制取干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞分离技术，尤其涉及一种羊膜中分离上皮细胞和间充质干细胞方法。

背景技术

羊膜是胚胎期发育的产物，羊膜细胞具有干细胞特性，且不表达人类白细胞抗原HLA-I及HLA-                                               ，无异体免疫排斥反应，因此适合用于细胞治疗，羊膜中的干细胞主要有上皮细胞和间充质干细胞。                     

羊膜上皮细胞具有亚全能干细胞特性，其分化能力强，可向三个胚层分化，并且无致瘤性及伦理学问题，是组织工程和细胞治疗的理想种子细胞。羊膜间充质干细胞有一定多向分化潜能，但相对羊膜上皮细胞其特点主要在于其具有免疫调节及促进造血恢复的功能。这两种细胞各有特点且在羊膜中含量丰富，因此探索有效可行的从羊膜中分离这两种细胞的方法，具有十分重要的意义。 目前广泛使用的酶解法利用胰蛋白酶及胶原酶将羊膜进行消化，并将消化产物接种培养，从而获得羊膜中的干细胞。但是使用胰蛋白酶对细胞损伤过大、消化时间长，导致消化下来的细胞不易贴壁生长，细胞成活率低，而消化时间短又不能得到足够的细胞。另外，分步多次消化会增加操作污染的几率，并使得分离步骤繁琐，且得到的细胞不纯，成功率低。  

发明内容

本发明公开了一种从人羊膜中制取干细胞的方法，用以解决现有技术中羊膜采集污染率高、采集后的细胞活性差，直接影响了后续的细胞分离及培养的问题。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其中，包括采集，分离，培养，冻存，检测；其中，分离过程中，羊膜上皮细胞采用酶消化法，继而羊膜间充质干细胞采用组织爬片法，两者分步连续完成。

如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其中，所述采集包括：

将采集的胎盘，放入含有0.2克/升链霉素和0.12克/升青霉素的D-Hanks液胎盘保护液的无菌袋内，将无菌袋进行密封并放入采集盒，将采集盒放入恒温采集箱，在24小时内将恒温采集箱送至干细胞库。

如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其中，所述恒温采集箱具体温度为2℃～8℃；所述采集胎盘至送入干细胞库的时间为12小时内。

如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其中，所述羊膜上皮细胞的分离具体包括：

将胎盘平铺在面积为400cm2圆盘内，用生理盐水将血丝冲洗干净；

用手术剪剪取整个正面的羊膜；

将羊膜放入面积为200cm2的圆盘中，使之铺展开，用止血钳除去羊膜上的血丝后，放入烧杯中，用生理盐水冲洗5~6次，每次使用100毫升~150毫升生理盐水；

之后通过酶消化法对羊膜进行处理，所述酶消化法具体包括：

将经生理盐水冲洗后的羊膜放入第一血浆瓶中，向其中加入浓度为2.5克/升的胰蛋白酶30毫升；

37℃恒温静止消化，使整块羊膜完全与胰蛋白酶充分接触后，经37℃恒温静止消化8分钟~12分钟；

将羊膜取出，弃消化液，将羊膜置于第二血浆瓶中，加入浓度为2.5克/升的胰蛋白酶30毫升，使整块羊膜完全与胰蛋白酶液充分接触后，经37℃恒温静止消化10分钟~20分钟；

消化结束后，用药勺在第二血浆瓶中将羊膜均匀搅拌0.5分钟~2分钟至消化液变为乳白色浑浊液体，再向其中加入2毫升胎牛血清终止消化；

用止血钳夹起羊膜，用100毫升生理盐水冲洗一遍后，收集消化液和冲洗液，并用100目细胞筛过滤；

将所得细胞悬液进行细胞计数，取50微升细胞悬液与50微升0.4%台盼蓝混匀后，用移液器打入血球计数板中，静置1分钟后，显微镜下观察计数；

过滤后的液体分装于50毫升离心管中，经300G~800G离心机工作5分钟；

将离心所得细胞用含5%胎牛血清和0.01毫克/升bFGF的DMEM/F12培养液15毫升吹打混匀后接种于第一个培养瓶中进行培养，或使用DMSO直接冻存。

如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其中，计数过程中对细胞数进行判断，如果细胞数大于2.0×10⁷则直接冻存；否则进行培养，培养至细胞数达到大于2.0×10⁷的标准后进行冻存。

如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其中，所述冻存的具体包括：

取DMSO1.35毫升于15毫升离心管中，再向其中加入3.15毫升的胎牛血清后制成混合液，于4℃环境下静止30分钟以上；