[发明专利]一种禽流感病毒裂解疫苗的制备方法

摘要

本发明公开了一种禽流感病毒裂解疫苗的制备方法，包括H7N9禽流感工作种子批毒种的建立、病毒接种与培养、病毒灭活、病毒收获液澄清与浓缩、病毒纯化、病毒裂解、再灭活、除糖除裂解剂、除菌过滤及半成品配制步骤；采用该方法制备的H7N9型流感疫苗免疫原性强，抗原谱广，质量稳定，纯度高，安全性好，成本低，适合于大规模生产，具有较大的应用价值。

主权项

一种禽流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）禽流感工作种子批毒种的建立：将来自于NIBSC的H7N9株禽流感病毒接种11日龄的SPF鸡胚，建立禽流感主代种子批毒种，从该禽流感主代种子批毒种中选择血凝效价高的毒种作为工作种子批建立毒种；（2）病毒接种与培养：于10日龄健康SPF鸡胚尿囊腔接种稀释为10‑5稀释度的H7N9禽流感工作种子批毒种，每胚0.1ml；将鸡胚置 33~35℃培养40~60小时；挑选活胚置4℃冷胚15~20小时，收获病毒尿囊液；（3）病毒灭活：将获得的病毒尿囊液中加入甲醛在40℃下灭活24~36小时；（4）病毒收获液澄清与浓缩：将灭活后的尿囊液进行澄清过滤，即经10 um滤膜粗滤后，再经0.45um滤膜进行两次过滤，然后用相对分子质量为1000K的超滤膜进行过滤和浓缩，最后用0.01mol/l的PBS浓缩，浓缩液中再加入0.25mol/lPB回收病毒液；（5）病毒纯化：蔗糖速率区带离心：分别用33%和56%蔗糖作为蔗糖密度梯度，以25000rpm/min的速度离心3小时；（6）病毒裂解：纯化后的病毒液加入等量的终浓度为0.3~1.0%的Triton X‑100，混匀后置20~25℃下作用2小时；（7）再灭活：将步骤（6）制得的裂解液加入甲醛在2~8℃下灭活24~36小时；（8）除糖除裂解剂：将步骤（6）制得的裂解物用相对分子质量为100K的超滤膜超滤浓缩10倍，去除蔗糖和大部分裂解剂；再用0.01mol/l的PBS浓缩20倍，最后用蔗糖密度梯度离心进行纯化，并收集各区段病毒液，进行血凝滴度、卵清蛋白和内毒素含量测定；其中，蔗糖密度梯度离心是在25000rpm/min的条件下离心1~3小时；（9）除菌过滤：将步骤（8）制得的病毒纯化液用0.2um孔径的滤膜过滤即为单价原液；（10）半成品配制：根据所配制的半成品总量计算原液用量，使血凝素含量为120ug/ml，再加入2.4 mg/ml的氢氧化铝佐剂，混匀后于20~25℃搅拌吸附4小时，即配制成H7N9禽流感病毒裂解疫苗的半成品。