[发明专利]一种禽流感病毒裂解疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于疫苗制备领域，具体涉及一种禽流感病毒裂解疫苗的制备方法。

背景技术

禽流感是禽流行性感冒的简称，它是由甲型流感病毒引起的传染性疾病，被国际兽疫局定为甲类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟，它能感染人类，人感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高；目前，主要采用疫苗进行预防，所用疫苗包括病毒灭活疫苗、减毒疫苗、重组亚单位疫苗等。

流感病毒颗粒外膜由两型表面糖蛋白覆盖，一型为血细胞凝集素（即H），一型为神经氨酸酶（即N），H又分15个亚型，N分9个亚型。所有人类的流感病毒都可以引起禽类流感，但不是所有的禽流感病毒都可以引起人类流感，禽流感病毒中，H3、H5、H7、H9可以传染给人，其中H5为高致病性，H3为人犬共患；依据流感病毒特征可分为HxNx共135种亚型，H7N9亚型禽流感病毒是其中的一种，往往在禽间发现，未发现过人感染的情况，这个病毒的生物学特点、致病力、传播力，还没有依据进行分析判断。

在针对禽流感H7N9病毒的疫苗研究方面，现有技术中尚未见良好疗效的针对H7N9亚型的粘膜免疫疫苗，更未有良好疗效的针对H7N9亚型病毒的多表位粘膜免疫疫苗，面对可能的禽流感H7N9病毒感染的流行，人们迫切需要一种新型、高效的疫苗来预防禽流感。

发明内容

本发明的目的在于提供一种禽流感病毒裂解疫苗的制备方法，该方法制备得到的疫苗能预防H7N9型病毒的感染。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

提供一种禽流感病毒裂解疫苗的制备方法，包括以下步骤：

（1）禽流感工作种子批毒种的建立：将来自于NIBSC的H7N9株禽流感病毒接种11日龄的SPF鸡胚，建立禽流感主代种子批毒种，从该禽流感主代种子批毒种中选择血凝效价高的毒种作为工作种子批建立毒种；

（2）病毒接种与培养：于10日龄健康SPF鸡胚尿囊腔接种稀释为10^-5稀释度的H7N9禽流感工作种子批毒种，每胚0.1ml；将鸡胚置33~35℃培养40~60小时；挑选活胚置4℃冷胚15~20小时，收获病毒尿囊液；

（3）病毒灭活：将获得的病毒尿囊液中加入甲醛在2~8℃下灭活24~36小时；

（4）病毒收获液澄清与浓缩：将灭活后的尿囊液进行澄清过滤，即经10 um滤膜粗滤后，再经0.45um滤膜进行两次过滤，然后用相对分子质量为1000K的超滤膜进行过滤和浓缩，最后用0.01mol/l的PBS浓缩，浓缩液中再加入0.25mol/lPB回收病毒液；

（5）病毒纯化：蔗糖速率区带离心：分别用33%和56%蔗糖作为蔗糖密度梯度，以25000rpm/min的速度离心3小时；

（6）病毒裂解：纯化后的病毒液加入等量的终浓度为0.3~1.0%的Triton X-100，混匀后置20~25℃下作用2小时；

（7）再灭活：将步骤（6）制得的裂解液加入甲醛在2~8℃下灭活24~36小时；

（8）除糖除裂解剂：将步骤（6）制得的裂解物用相对分子质量为100K的超滤膜超滤浓缩10倍，去除蔗糖和大部分裂解剂；再用0.01mol/l的PBS浓缩20倍，最后用蔗糖密度梯度离心进行纯化，并收集各区段病毒液，进行血凝滴度、卵清蛋白和内毒素含量测定；其中，蔗糖密度梯度离心是在25000rpm/min的条件下离心1~3小时；

（9）除菌过滤：将步骤（8）制得的病毒纯化液用0.2um孔径的滤膜过滤即为单价原液；

（10）半成品配制：根据所配制的半成品总量计算原液用量，使血凝素含量为120ug/ml，再加入2.4 mg/ml的氢氧化铝佐剂，混匀后于20~25℃搅拌吸附4小时，即配制成H7N9禽流感病毒裂解疫苗的半成品。

步骤（5）中，病毒纯化的具体过程为：当区带离心转速达到3000rpm/min时，泵入病毒液、33%蔗糖及56%蔗糖，并加入PBS作为封闭液，进样完毕，同时调节机器转速至25000rpm/min，离心3小时。

综上所述，本发明的制备方法制备的H7N9型流感疫苗免疫原性强，抗原谱广，质量稳定，纯度高，安全性好，成本低，适合于大规模生产，具有较大的应用价值。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述，但它们不是对本发明的进一步限制。

实施例1