[发明专利]一种丙烯酰胺酶标记仿生免疫分析方法

摘要

本发明涉及一种丙烯酰胺酶标记仿生免疫分析方法，包括半抗原的合成、酶标抗原的制备、亲水性分子印迹聚合物膜的制备以及标准曲线的建立等步骤。本发明是以制备的亲水性的丙烯酰胺分子印迹聚合物膜作为人工抗体代替生物抗体，利用酶联免疫吸附测定原理，建立对丙烯酰胺具有广泛检测范围的高灵敏检测方法。克服了传统生物抗体制备周期长、易失活、成本高等缺点，并且大大缩短了分析时间。本发明成本低廉，实验操作简单，灵敏度高，适用于各种食品中丙烯酰胺的快速检测。

主权项

一种丙烯酰胺酶标记仿生免疫分析方法，其特征在于包括以下步骤：1）将1～2g8‑氨基辛酸溶于5～15mL3mol L‑1的氢氧化钾溶液，在冰浴、磁力搅拌条件下，缓慢滴加0.5～2mL的10～15mmol丙烯酰氯溶液，同时不断滴加氢氧化钾溶液，以维持反应液pH=8～9；冰浴反应1h，自然升温至室温继续搅拌反应4h；停止反应后乙醚洗2次，醚层弃去；搅拌条件下，向水层缓慢滴加5mol L‑1盐酸，调节pH值至3，继续搅拌10min；10～20mL氯仿连续萃取3次；合并氯仿层，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液浓缩至尽干，加入乙醚放置过夜，晶体析出，乙醚重结晶得丙烯酰胺半抗原；2）将步骤1）制备的丙烯酰胺半抗原溶于二甲基甲酰胺中，然后加入与丙烯酰胺半抗原摩尔比1:1的N‑羟基丁二酰亚胺和1:2的N,N'‑二环己基碳酰亚胺，室温搅拌反应2～4h，离心取上清液，作为溶液a；取辣根过氧化物酶，溶于50mmol L‑1K2HPO4缓冲水溶液中，作为溶液b；取50～200μL溶液a缓慢逐滴加入溶液b中，4℃反应8～12h；取出后在室温下放置1～2h，然后将混合液透析2～3天；收集透析液得到酶标抗原标准溶液，4℃保存备用；3）将丙烯酰胺、甲基丙烯酸和二甲基丙烯酸乙二醇酯按照摩尔比1:2:4混合，然后加入10～20mg偶氮二异丁腈，搅拌反应1～2h；96孔酶标板上每孔加入200μL上述混合液，氮气保护条件下38℃聚合反应12～24h，用3～9:1v/v甲醇/冰乙酸溶液洗脱4～10h，甲醇溶液洗脱2～4h以除去丙烯酰胺，干燥后得亲水性分子印迹聚合物膜；4）步骤3）制备的亲水性分子印迹聚合物膜作为仿生抗体；步骤2）制备的酶标抗原标准溶液用PBS溶液稀释3000倍作为酶标稀释液；以丙烯酰胺标样梯度稀释液浓度的对数值为横坐标，相应的抑制率百分数为纵坐标，绘制分析方法标准曲线；5）称取1～2g待测样品，粉碎后加入5～10mL PBS溶液超声提取3次，过滤得样品提取液；将样品提取液代替上述丙烯酰胺标样梯度稀释液，进行仿生免疫分析操作，根据抑制率由标准曲线计算出待测物中丙烯酰胺的含量。