[发明专利]一种丙烯酰胺酶标记仿生免疫分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种丙烯酰胺酶标记仿生免疫分析方法，属于食品安全检测技术领域，特别是一种丙烯酰胺的快速、灵敏检测方法。

背景技术

丙烯酰胺（Acrylamide）是一种合成聚丙烯酰胺和其他共聚物的有机单体，在食品中一般是富含淀粉类原料经过高温处理生成的有害物质，毒理学实验表明其具有神经毒性、致癌性和生殖发育毒性。2002年4月科研人员报道在油炸食品中检测到大量丙烯酰胺。因此，加强丙烯酰胺的检测和控制成为食品安全领域研究的重点。

目前国内外有关食品中丙烯酰胺的检测方法大多采用气相色谱法、液相色谱法、气相色谱与质谱联用法、酶联免疫法进行定性、定量的检测。仪器检测所使用的设备价格昂贵，通常还需要复杂样品前处理技术，费时费力；酶联免疫法虽然具有高灵敏度和低检出限，但是丙烯酰胺是小分子物质，特异性强的丙烯酰胺生物抗体难制备，并且保存不当容易失活。丙烯酰胺分子印迹聚合物作为仿生抗体，具有选择性高，制备周期短，不失活易保存等优点，因此作为人工抗体应用于酶联免疫分析，建立仿生免疫吸附检测技术，用于检测食品中的丙烯酰胺具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服传统的丙烯酰胺检测方法存在检测时间长、仪器价格昂贵、特异性抗体难制备等缺陷，提供一种丙烯酰胺的快速检测方法。

本发明采取的技术方案是：

一种丙烯酰胺酶标记仿生免疫分析方法，其特征在于包括以下步骤：

1.半抗原的合成：1～2g8-氨基辛酸溶于5～15mL3mol L^-1的氢氧化钾溶液，在冰浴、磁力搅拌条件下，缓慢滴加0.5～2mL的10～15mmol丙烯酰氯溶液，同时不断滴加氢氧化钾溶液，以维持反应液pH=8～9。冰浴反应1h，自然升温至室温继续搅拌反应4h。停止反应后乙醚洗2次，醚层弃去。搅拌条件下，向水层缓慢滴加5mol L^-1盐酸，调节pH值至3，继续搅拌10min。10～20mL氯仿连续萃取3次。合并氯仿层，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液浓缩至尽干，加入乙醚放置过夜，晶体析出，乙醚重结晶得丙烯酰胺半抗原。

2.酶标抗原的制备：将步骤1）制备的丙烯酰胺半抗原溶于二甲基甲酰胺中，然后加入N-羟基丁二酰亚胺（N-羟基丁二酰亚胺与丙烯酰胺半抗原摩尔比1:1）和N,N'-二环己基碳酰亚胺（N,N'-二环己基碳酰亚胺与丙烯酰胺半抗原摩尔比1:2），室温搅拌反应2～4h，离心取上清液，作为溶液a。取辣根过氧化物酶，溶于50mmol L^-1K₂HPO₄缓冲水溶液中，作为溶液b。取50～200μL溶液a缓慢逐滴加入溶液b中，4℃反应8～12h。取出后在室温下放置1～2h，然后将混合液透析2～3天。收集透析液得到酶标抗原标准溶液，4℃保存备用。

3.亲水性分子印迹聚合物膜的制备：丙烯酰胺（溶于乙腈和水）、甲基丙烯酸和二甲基丙烯酸乙二醇酯按照1:2:4摩尔比混合，然后加入10～20mg偶氮二异丁腈，搅拌反应1～2h。96孔酶标板上每孔加入200μL上述混合液，氮气保护条件下38℃聚合反应12～24h，用3～9:1（v/v）甲醇/冰乙酸溶液洗脱4～10h，甲醇溶液洗脱2～4h以除去丙烯酰胺，干燥后得亲水性分子印迹聚合物膜。

4.酶标记仿生免疫分析方法的建立：步骤3）制备的亲水性分子印迹聚合物膜作为仿生抗体；步骤2）制备的酶标抗原标准溶液用PBS溶液（5倍PBS：Na₂HPO₄·12H₂O：68.80g，NaH₂PO₄·2H₂O：8.97g，NaCl：45.00g，加双蒸水至1L。将5倍PBS用双蒸水稀释5倍即为PBS溶液。）稀释3000倍作为酶标稀释液。以丙烯酰胺标样梯度稀释液浓度的对数值为横坐标，相应的抑制率百分数为纵坐标，绘制分析方法标准曲线，建立仿生免疫分析方法。

5.称取1～2g待测样品，粉碎后加入5～10mL PBS溶液超声提取3次，过滤得样品提取液。将样品提取液代替上述丙烯酰胺标样梯度稀释液，进行仿生免疫分析操作，根据抑制率由标准曲线计算出待测物中丙烯酰胺的含量。

本发明的优点和积极效果是：

1.本发明提供的丙烯酰胺吸附功能材料具有较高的选择性，可以代替生物抗体应用于酶联免疫技术；该吸附功能材料由化学方法制备，具有较高的稳定性、较长的使用寿命和较强的抗恶劣环境的能力，克服了传统生物抗体制备周期长、易失活、成本高等缺点。