[发明专利]一种提高Vγ9Vδ2T细胞扩增效率及活性的培养方法

摘要

本发明提供一种提高Vγ9Vδ2T细胞扩增效率及活性的培养方法，应用IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼体外诱导Vγ9Vδ2T细胞的生成，得到了诱导效率更高及活性更高的Vγ9Vδ2T细胞本发明方法诱导培养过程简单易行，周期短，成本低廉；诱导效率高，重复性好；诱导后得到的细胞活性增强，诱导培养后细胞数量和功能有望提高目前Vγ9Vδ2T细胞免疫治疗肿瘤的疗效，具有很好的应用潜能。

主权项

一种提高Vγ9Vδ2T细胞扩增效率及活性的培养方法，其特征在于，通过以下步骤实现：（1）人单个核细胞制备：应用人淋巴细胞分离液分离制备外周血单个核细胞，用含10%胎牛血清完全RPMI 1640培养液重悬细胞；（2）Vγ9Vδ2T细胞诱导：步骤（1）中所制备的单个核细胞接种当日按第0天计算，在第0天加入唑唻膦酸及IL‑2，在第1天加入达沙替尼，接着于第3、6、9、12、15、18天进行半量换液，每次换液时加入新鲜IL‑2及达沙替尼；（3）Vγ9Vδ2T细胞扩增效率检测：于第9、12、15、18天收集步骤（2）中的细胞，采用流式细胞术检测Vγ9Vδ2T细胞的纯度，以TCRVδ2阳性作为Vγ9Vδ2T细胞的表型特征，计算Vγ9Vδ2T细胞占外周血单个核细胞的百分含量；采用细胞计数仪检测活细胞密度，并根据以下公式计算Vγ9Vδ2T细胞的绝对数量：Vγ9Vδ2T细胞绝对数量= Vγ9Vδ2T细胞纯度×活细胞密度×总体积；（4）诱导的Vγ9Vδ2T细胞表面活化分子及死亡受体检测：于第18天收集步骤（2）中的细胞，采用流式细胞术检测Vγ9Vδ2T细胞表面活化分子CD69、HLA‑DR及死亡受体Fas分子表达的比例，以TCRVδ2阳性作为Vγ9Vδ2T细胞的表型特征，计算公式为：Vγ9Vδ2T细胞CD69/HLA‑DR/ Fas表达（%）= CD69/HLA‑DR/Fas和TCRVδ2双阳性细胞/ TCRVδ2单阳性细胞×100；（5）诱导的Vγ9Vδ2T细胞效应型亚群比例检测：于第18天收集步骤（2）中的细胞，采用流式细胞术检测Vγ9Vδ2T细胞的功能亚型分布，以TCRVδ2阳性作为Vγ9Vδ2T细胞的表型特征，以CD27分子为区分效应型亚群的表型特征，计算公式为：Vγ9Vδ2T细胞效应型亚群比例（%）= CD27阴性TCRVδ2阳性细胞/ TCRVδ2单阳性细胞×100；（6）诱导的Vγ9Vδ2T细胞对肿瘤细胞的的穿孔素、颗粒酶释放效应检测：于第18天收集步骤（2）中的细胞，采用流式细胞术检测Vγ9Vδ2T细胞与急性髓系白血病细胞株K562共同孵育4个小时后检测Vγ9Vδ2T细胞对AML细胞刺激的穿孔素、颗粒酶释放效应，以TCRVδ2阳性作为Vγ9Vδ2T细胞的表型特征，以CD107a分子阳性作为穿孔素、颗粒酶释放效应的检测标记，计算公式为：Vγ9Vδ2T细胞穿孔素、颗粒酶释放效应（%）= CD107a和TCRVδ2双阳性细胞/ TCRVδ2单阳性细胞×100；（7）诱导的Vγ9Vδ2T细胞干扰素‑γ细胞因子分泌能力检测：于第18天收集步骤（2）中的细胞，采用流式细胞术检测Vγ9Vδ2T细胞在PMA/离子霉素刺激4个小时后检测Vγ9Vδ2T细胞干扰素‑γ细胞因子的分泌能力，以TCRVδ2阳性作为Vγ9Vδ2T细胞的表型特征，以胞内干扰素‑γ分子阳性作为Vγ9Vδ2T细胞分泌干扰素‑γ细胞因子的检测标记，计算公式为：    Vγ9Vδ2T细胞IFN‑γ分泌能力（%）=干扰素‑γ和TCRVδ2双阳性细胞/ TCRVδ2单阳性细胞×100。