[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒变异株N基因全序列的扩增方法

摘要

本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒变异株N基因全序列的扩增方法，包括如下具体步骤：1.提取猪流行性腹泻病毒变异株RNA；2.依据猪流行性腹泻病毒变异株的N基因全序列设计引物，并用RT-PCR的方法扩增猪流行性腹泻病毒变异株的N基因；3.PCR产物的克隆与测序分析：将PCR产物纯化并连接pMD18-T载体，转化trans5a感受态细胞，筛选阳性克隆，将阳性克隆进行测序分析。可以通过该方法扩增获取病料中猪流行性腹泻病毒变异株的N基因、并可以捕获猪流行性腹泻病毒变异株在细胞培养传代过程中N基因序列的变化。也可以作为一种检测病料中PEDV的方法，并为PEDV的N基因相关研究奠定基础。

主权项

一种猪流行性腹泻病毒变异株N基因全序列的扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：1）提取病毒RNA：（1）取猪腹泻的粪便、肠道病料或各代次病毒培养液200μL移入灭菌的1.5ml离心管中，然后加入800μL的Trizol试剂，剧烈震荡摇匀；（2）室温下保持5 min，加0.2ml氯仿，颠转混匀，然后在冰盒上放置10 min后，4℃,12000 g离心10 min；（3）将上层水相转移到新的1.5ml离心管中，加入等量异丙醇，颠倒混匀，‑20℃放置20 min；4℃,12000 g离心20 min，RNA就会在管的侧壁和底部形成沉淀； （4）弃上清液，加入75%的乙醇洗涤沉淀，然后4℃,7500 g离心5 min，弃去乙醇；（5）沉淀于室温下充分风干后，溶于15至20μL DEPC水中，‑20℃保存备用；2） RT‑PCR扩增：根据GenBank公开的猪流行性腹泻病毒变异株N基因序列，设计RT‑PCR引物，引物序列如下： PEDV‑NF：5’‑ATGGCTTCTGTCAGTTTTCAGGAT‑3’PEDV‑NR：5’‑TTAATTTCCTGTGTCGAAGATCTCGTTG‑3’以步骤1所得的病毒总RNA为模板，用上述引物，使用TransGen Biotech的One‑step RT‑PCR SuperMix试剂盒扩增猪流行性腹泻病毒PEDV的N基因，PCR的反应参数是：45℃，30min；94℃,5min；94℃ 30s，58℃ 30s,72℃ 2min，共35个循环；72℃延伸10min；3） PCR产物的克隆及测序分析：（1）PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取1400bp的N基因目的条带，使用Axygen DNA凝胶回收试剂盒回收；（2）回收纯化的PCR产物连接pMD18‑T载体，转化trans5a感受态细胞，筛选阳性克隆，将阳性克隆进行测序分析。