[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒变异株N基因全序列的扩增方法

说明书

技术领域

本发明涉及猪流行性腹泻病毒变异株N基因序列的扩增。属于生物检测技术领域。

背景技术

猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV）引起的一种急性、高度接触性的传染病，常以急性肠炎和伴有脱水的水样腹泻为特征，各种年龄的猪均易感和对哺

乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病。本病于1971年首先发现于英国，1978 年在英国和比利时首次报道，此后，欧洲和亚洲各国也报道了该病的暴发。我国在1973年分离到PEDV（经典毒株）。

2010年冬季至2011年春季全国各地猪场的猪群中先后发生严重的传染性腹泻疾病，发病突然，传播较快，流行范围广，流行时间长，应用各种抗生素防治无效，其发病率与死亡率很高，造成重大的经济损失。经研究表明，猪流行性腹泻病毒变异株是此次疫情的元凶（Jianfei Chen等Complete Genome Sequence of a Porcine Epidemic Diarrhea Virus Variant. J. Virol, 2012, 86: 3408）。

    PEDV的N基因高度保守，例如，CV777和Brl/87两个分离株N基因序列仅有2个碱基的差异，LJB/03株与其他毒株的同源性也均在95%以上。N蛋白是由441个氨基酸组成、分子质量为55-58 ku、磷酸化的核衣壳蛋白，与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳，在病毒RNA合成过程中发挥重要作用。且N蛋白在PEDV的结构蛋白中所占比例最大，在感染的细胞中能得到大量表达。猪在感染PEDV的早期, 体内就能产生抗N蛋白的高水平抗体，所以利用N蛋白来建立PEDV诊断技术具有很好的应用前景。

由于N基因编码的N蛋白为衣壳蛋白，因此可以通过基因序列的变化来分析PEDV病毒的变异，为进一步分析我国PEDV变异株的遗传变异规律奠定基础。因此，本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒变异株N基因全序列的扩增方法，该方法能够扩增PEDV变异株N基因的全长，特别是在Vero细胞上培养的不同代次的PEDV种毒的N基因全长。通过该方法可以捕获到PEDV变异株在细胞培养传代过程中N基因全序列的变化，从而通过N基因的遗传变异分析了解其与PEDV毒力或者免疫力的相关性。该方法扩增的目的片段长1326 bp，包含PEDV变异株全长N基因。

 

发明内容

技术问题  

本发明目的在于提供一种用于扩增猪流行性腹泻病毒变异株N基因全序列的方法。

技术方案 

本发明通过分析GenBank中公开的猪流行性腹泻病毒变异株的N基因序列，设计引物。所述的引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列如下：

PEDV-NF：5’-ATGGCTTCTGTCAGTTTTCAGGAT-3’

PEDV-NR：5’-TTAATTTCCTGTGTCGAAGATCTCGTTG-3’。 该引物从感染猪流行性腹泻病毒变异株的病料中可扩增出1326 bp DNA片段。

具体地，本发明中扩增猪流行性腹泻病毒变异株N基因的方法是以样品总RNA为模板，进行RT-PCR反应，扩增出目的基因，纯化后即可获得猪流行性腹泻病毒N基因片段。

具体步骤如下：

1、提取病毒RNA：

    取猪腹泻猪的粪便、肠道病料或各代次病毒培养液200μL移入灭菌的1.5ml离心管中，然后加入800μL的Trizol试剂，剧烈震荡摇匀；室温下保持5 min，加0.2ml氯仿，颠转混匀，然后在冰盒上放置10 min后，4℃,12000 g离心10 min；将上层水相转移到新的1.5ml离心管中，加入等量异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置20 min；4℃,12000 g离心20 min，RNA就会在管的侧壁和底部形成沉淀； 弃上清液，加入75%的乙醇洗涤沉淀，然后4℃,7500 g离心5 min，弃去乙醇；沉淀于室温下充分风干后，溶于15至20μL DEPC水中，-20℃保存备用。

2、RT-PCR扩增：

根据GenBank中公开的猪流行性腹泻病毒变异株N基因序列，设计RT-PCR引物，引物序列如下：

 PEDV-NF：5’-ATGGCTTCTGTCAGTTTTCAGGAT-3’

PEDV-NR：5’-TTAATTTCCTGTGTCGAAGATCTCGTTG-3’