[发明专利]一种基于G-四链体核酸酶的毒素检测方法

摘要

本发明公开了一种基于G-四链体核酸酶的微囊藻毒素(MC-LR)检测方法,属于免疫分析化学技术领域。本发明成功的制备了具有类似过氧化物酶活性的四链体-血晶素的复合物，并把此复合物偶联到金纳米粒子表面，用于信号放大的作用，最后成功的把金纳米粒子-四链体的偶联物标记到抗体上去。利用此新的抗体标记物，建立了基于G-四链体DNA酶的免疫检测新方法实现对藻毒素的检测。本发明的方法是一种简单、快速和便捷的方法，此方法体现出了良好的灵敏性和选择性，利用四链体的信号放大的作用，提高了检测的灵敏度，可实现水中藻毒素的简单、快速、高灵敏检测，达到国际领先水平。

主权项

一种基于G‑四链体核酸酶的微囊藻毒素检测方法，包括如下步骤：(1) 金纳米粒子的合成；参照Frens的柠檬酸三钠还原法合成直径为25纳米的金纳米粒子； (2) 金纳米粒子的功能化； 将巯基修饰的DNA溶液加入到纳米金粒子溶液中，缓慢加入氯化钠溶液，室温反应10‑15小时，得金纳米粒子‑核酸偶联物，完成金纳米粒子的功能化； (3)DNA和血晶素复合物的制备；向金纳米粒子‑核酸偶联物中加入血晶素，使偶联在金纳米粒子表面的DNA在血晶素作用下折叠形成四链体结构，最终得到DNA和血晶素复合物，即具有类过氧化物酶性质的四链体复合物DNA‑AuNPs；(4) 四链体偶联抗体的探针的装配；将金纳米粒子上的四链体复合物与抗体偶联得到最终的检测探针DNA‑AuNPs‑Ab；(5) 标准曲线的建立；将抗藻毒素的抗体和稀释的藻毒素MC‑LR的标准品溶液加入到含有包被原的酶标板孔里，通过抗体、微囊藻毒素MC‑LR、包被原的竞争过程，将DNA‑AuNPs‑Ab探针加入到孔里与藻毒素抗体反应，最后四链体催化双氧水介导的氧化ABTS的反应，反应结束后检测各个孔的有色产物的吸光值来绘制标准曲线；运用MC‑LR的浓度作为横坐标，反应液的中信号分子的强度，吸光值作为纵坐标建立抑制标准曲线；检测限(LOD) 通过公式 LOD=3.3SD/S计算得出，SD 为变异系数，S是标准曲线的斜率，构建标准曲线；(6) 对样品进行检测；以待测样品取代步骤（5）中的藻毒素MC‑LR的标准品进行同样的反应，最后得到吸光值数值，再根据检测标准曲线建立的标准曲线回归方程计算出待测样品中藻毒素的含量。