[发明专利]一种建立猪iPS细胞系的培养基及其培养方法

摘要

本发明公开了一种建立猪iPS细胞系的培养基及其培养方法，经过OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC四个转录因子进行转染，并通过培养基的诱导培养，第9天时出现典型的猪iPS细胞能够高效获得猪iPS细胞；所获得的猪iPS细胞克隆为扁平的克隆，边缘整齐，和人的ES细胞形态相似。本发明构建的猪iPS细胞系，传代培养的猪iPS细胞能保持不分化的状态，经AP染色显示结果为阳性，具有多能性标记，在体外、体外分化后的细胞表达NCSTN（内胚层）、NESTIN（外胚层）及DESMIN（中胚层）。

主权项

一种建立猪iPS细胞系的培养方法，其特征在于，包括以下操作：1）将Oct4、Sox2、Klf4、c‑Myc四种转录因子分别通过逆转录病毒载体和病毒包装载体转染细胞，在转染48h后分别收集包含了转录因子的重组病毒；2）将猪胎儿成纤维细胞于转染前用胰酶消化，然后接种到猪胎儿成纤维细胞培养基上，然后再加入包含Oct4、Sox2、Klf4、c‑Myc四种转录因子的重组病毒进行病毒感染，于37℃、5%CO2条件下培养，病毒感染后72h，再次加入重组病毒进行二次病毒感染；所述的猪胎儿成纤维细胞培养基是在DMEM培养基上，添加体积浓度为10%的胎牛血清；3）二次病毒感染后24h，将感染后的猪胎儿成纤维细胞用胰酶消化，接种到猪胎儿成纤维细胞培养基上贴壁生长24h，于37℃、5%CO2条件下培养，然后将猪胎儿成纤维细胞培养基更换为猪iPS细胞诱导培养基，无饲养层条件下培养；100ml所述的猪iPS细胞诱导培养基为：85ml DMEM培养基、15ml10%FBS、1ml0.1mM NEAA、1ml2mM谷氨酰胺，1μg bFGF，1μg hLIF，30μl10mM的CHIR99021，20μl10mM的SB431542，1μg hBMP4，185μl0.1mMβ‑巯基乙醇，50IU/mL青霉素和50μg/mL链霉素；4）待培养基上出现猪iPS细胞克隆后，挑去克隆并扩大培养。