[发明专利]一种以愈伤组织为外植体的杂交杨农杆菌转化方法

摘要

本发明公开了一种以愈伤组织为外植体的杂交杨农杆菌转化方法，包括下述步骤：（1）愈伤诱导；（2）愈伤组织预培养；（3）菌种活化与培养；（4）侵染；（5）共培养；（6）延迟选择；（7）诱导不定芽；（8）伸长培养；（9）诱导生根及检测，验证农杆菌基因转化了的杂交杨树。本发明的方法克服了现有技术因以杨树茎段或叶柄为外植体的杂交杨农杆菌转化方法后期染菌而被迫不断继代的缺点，可以用少量愈伤组织外植体快速获得的抗性转基因杨树，周期短、染菌率低、转化效率高，为大规模的转基因杨树提供了一种技术手段。

主权项

一种以愈伤组织为外植体的杂交杨农杆菌转化方法，其特征包括下述步骤： （1）愈伤诱导： 将717杨树的腋芽或顶芽置于基本培养基上继代繁殖，培养4‑6周获得组培苗；切取所述组培苗0.8‑1.5cm不带腋芽的茎段，用刀片沿着茎段纵轴方向划2‑3次造成伤口或切取所述组培苗的带有0.1‑0.5cm2叶片的叶柄置于M1'固体培养基中，于24‑26℃黑暗条件下预培养12‑15天；更换一次M1'固体培养基，继续在24‑26℃黑暗条件下预培养12‑15天，有愈伤组织生成； （2）愈伤组织预培养： 将步骤（1）获得的愈伤组织切成0.4‑0.6cm3的块，置于M1固体培养基预配养2‑3天； （3）菌种活化与培养： 用移液枪枪头挑取‑80℃保存的农杆菌至含有抗生素的YEB固体培养基上，27‑29℃倒置暗培养20‑28h；挑取培养后的农杆菌在另一含有抗生素的YEB固体培养基上划线，27‑29℃倒置暗培养36‑48h； 挑取单菌落至2‑4mL含有抗生素的YEB液体培养基的无菌试管中，150‑200rpm27‑29℃暗培养12‑16h；吸取0.1‑1.0mL菌液放置于50‑75mL含有抗生素的YEB液体培养基的锥形瓶中，150‑200rpm27‑29℃暗培养至菌液OD600=0.6‑0.8； （4）侵染： 将步骤（3）获得的菌液在室温、3500‑4000rpm离心10‑15min，弃去上清液，将沉淀用50‑75mL M液重悬，得到侵染液，按30‑50个/25mL的比例将经步骤（2）预培养的愈伤组织放入所述侵染液中，24‑26℃条件下80‑100rpm侵染10‑20min； （5）共培养： 取出侵染后的愈伤组织，吸干表面残留的侵染液，放在M1固体培养基上，24‑26℃，暗条件下培养24‑36小时； （6）延迟选择： 取出步骤（5）培养的愈伤组织，弃掉因侵染而褐变的愈伤组织，先用去离子水在180‑220rpm下洗涤4‑5min，洗涤2‑3次，再用浓度为350‑500mg/L的头孢霉素‑去离子水溶液150‑200rpm洗涤4‑5min，洗涤2‑3次，吸干表面水分并转移至CIM固体选择培养基中，24‑26℃于黑暗条件下培养3‑5天，舍弃与CIM固体选择培养基的接触处可见白色农杆菌菌落的愈伤组织，将剩余愈伤组织转移到新鲜的CIM固体选择培养基中，500‑800Lux弱光下培养5‑8天； （7）诱导不定芽： 将步骤（6）获得的愈伤组织转移至SIMa固体培养基中，22‑26℃1500‑2000Lux，光照周期为光照/黑暗16h/8h的条件下进行培养，得到表面为白色或白色略带褐化的愈伤组织，每 14‑21天更换一次SIMa固体培养基；待白色或白色略带褐化的愈伤组织表面出现绿色的愈伤组织，用解剖刀剥离绿色的愈伤组织转移至新鲜SIMa固体培养基中22‑26℃1500‑2000Lux光照条件下培养，待绿色愈伤组织表面开始长出玻璃化的不定芽；将带有玻璃化不定芽的绿色愈伤组织转移到含有SIMb固体培养基的组培瓶中，直到不定芽生长至1‑2cm； （8）伸长培养： 切取不定芽转移至含有SEM固体培养基的组培瓶中24‑26℃1500‑2000Lux光照条件下培养2‑4周，获得表型趋于正常的芽； （9）诱导生根及检测： 取步骤（8）获得的芽，切去底部膨大部位，转入RM固体培养基中，24‑26℃1500‑2000Lux光照下诱导生根，从已生根的再生杨树上剪取叶片提取基因组DNA，并进行全基因组PCR检测，验证农杆菌基因转化了的杂交杨树。