[发明专利]一种以愈伤组织为外植体的杂交杨农杆菌转化方法

权利要求书

1.一种以愈伤组织为外植体的杂交杨农杆菌转化方法，其特征包括下述步骤： 

（1）愈伤诱导： 

将717杨树的腋芽或顶芽置于基本培养基上继代繁殖，培养4-6周获得组培苗；切取所述组培苗0.8-1.5cm不带腋芽的茎段，用刀片沿着茎段纵轴方向划2-3次造成伤口或切取所述组培苗的带有0.1-0.5cm²叶片的叶柄置于M1'固体培养基中，于24-26℃黑暗条件下预培养12-15天；更换一次M1'固体培养基，继续在24-26℃黑暗条件下预培养12-15天，有愈伤组织生成； 

（2）愈伤组织预培养： 

将步骤（1）获得的愈伤组织切成0.4-0.6cm³的块，置于M1固体培养基预配养2-3天； 

（3）菌种活化与培养： 

用移液枪枪头挑取-80℃保存的农杆菌至含有抗生素的YEB固体培养基上，27-29℃倒置暗培养20-28h；挑取培养后的农杆菌在另一含有抗生素的YEB固体培养基上划线，27-29℃倒置暗培养36-48h； 

挑取单菌落至2-4mL含有抗生素的YEB液体培养基的无菌试管中，150-200rpm27-29℃暗培养12-16h；吸取0.1-1.0mL菌液放置于50-75mL含有抗生素的YEB液体培养基的锥形瓶中，150-200rpm27-29℃暗培养至菌液OD₆₀₀=0.6-0.8； 

（4）侵染： 

将步骤（3）获得的菌液在室温、3500-4000rpm离心10-15min，弃去上清液，将沉淀用50-75mL M液重悬，得到侵染液，按30-50个/25mL的比例将经步骤（2）预培养的愈伤组织放入所述侵染液中，24-26℃条件下80-100rpm侵染10-20min； 

（5）共培养： 

取出侵染后的愈伤组织，吸干表面残留的侵染液，放在M1固体培养基上，24-26℃，暗条件下培养24-36小时； 

（6）延迟选择： 

取出步骤（5）培养的愈伤组织，弃掉因侵染而褐变的愈伤组织，先用去离子水在180-220rpm下洗涤4-5min，洗涤2-3次，再用浓度为350-500mg/L的头孢霉素-去离子水溶液150-200rpm洗涤4-5min，洗涤2-3次，吸干表面水分并转移至CIM固体选择培养基中，24-26℃于黑暗条件下培养3-5天，舍弃与CIM固体选择培养基的接触处可见白色农杆菌菌落的愈伤组织，将剩余愈伤组织转移到新鲜的CIM固体选择培养基中，500-800Lux弱光下培养5-8天； 

（7）诱导不定芽： 

将步骤（6）获得的愈伤组织转移至SIMa固体培养基中，22-26℃1500-2000Lux，光照周期为光照/黑暗16h/8h的条件下进行培养，得到表面为白色或白色略带褐化的愈伤组织，每 14-21天更换一次SIMa固体培养基；待白色或白色略带褐化的愈伤组织表面出现绿色的愈伤组织，用解剖刀剥离绿色的愈伤组织转移至新鲜SIMa固体培养基中22-26℃1500-2000Lux光照条件下培养，待绿色愈伤组织表面开始长出玻璃化的不定芽；将带有玻璃化不定芽的绿色愈伤组织转移到含有SIMb固体培养基的组培瓶中，直到不定芽生长至1-2cm； 

（8）伸长培养： 

切取不定芽转移至含有SEM固体培养基的组培瓶中24-26℃1500-2000Lux光照条件下培养2-4周，获得表型趋于正常的芽； 

（9）诱导生根及检测： 

取步骤（8）获得的芽，切去底部膨大部位，转入RM固体培养基中，24-26℃1500-2000Lux光照下诱导生根，从已生根的再生杨树上剪取叶片提取基因组DNA，并进行全基因组PCR检测，验证农杆菌基因转化了的杂交杨树。 

2.根据权利要求1所述的一种以愈伤组织为外植体的杂交杨农杆菌转化方法，其特征是步骤（1）所述基本培养基的组成为：MS盐2.2g，蔗糖20-30g，琼脂7-7.2g，定容至1L，pH5.6-5.8；所述M1'固体培养基的组成为：MS盐4.4g，蔗糖20-30g，生长素NAA1.86mg，细胞分裂素2ip1.02mg，琼脂7-7.2g，定容至1L，pH=5.6-5.8。