[发明专利]体外诱导生成含L‑ASPaseII的红细胞药物的方法

摘要

本发明公开了一种体外诱导生成含L‑ASPase II的红细胞药物的方法，包括以下步骤1）使用慢病毒载体系统改造诱导性多能干细胞Ⅰ.构建pLenti6.3/V5‑GW/Em‑GFP VerA‑L‑ASPase II质粒；Ⅱ.使用293T细胞包装生成高滴度的含L‑ASPase II的病毒颗粒；Ⅲ.使用病毒颗粒转染诱导性多能干细胞；2）体外诱导诱导性多能干细胞生成含L‑ASPase II的红细胞Ⅰ.IPS细胞体外分化诱导成红细胞体EB；Ⅱ.EB诱导分化成成熟红细胞。本发明通过对IPS细胞使用慢病毒载体系统进行基因改造，并将之在体外诱导生成含有L‑ASPase II的红细胞，生成的红细胞既能够作为L‑ASPase II的缓释载体使用，又能够保持红细胞原有的形态功能，进一步降低了L‑ASPase II的毒副作用，为今后的临床应用打下坚实的基础。

主权项

体外诱导生成含L‑ASPase II的红细胞药物的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)使用慢病毒载体系统改造诱导性多能干细胞：Ⅰ.构建pLenti6.3/V5‑GW/Em‑GFP VerA‑L‑ASPase II质粒，构建方法如下：1)构建克隆载体：目的基因为L‑天冬酰胺酶II基因，目的基因通过BamH I和EcoR I酶切位点连接到pUC57载体上，构建成克隆载体pUC57‑L‑ASPase II；2)构建表达载体：质粒pUC57‑L‑ASPase II和载体质粒pLenti6.3/V5‑GW/Em‑GFP VerA同时使用BamH I和EcoR I酶进行双酶切，酶切体系：10×buffer 2μl，BamH I和EcoR I各0.4μl，质粒溶液4μl，质粒浓度为0.35μg/μl，ddH2O 13.2μl，总体积20μl；酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定；回收L‑ASPase II基因片段和载体片段pLenti6.3/V5‑GW/Em‑GFP VerA，16℃连接，过夜，连接产物转化至E.coli DH5α感受态菌；在琼脂平板上挑取10个克隆，每个克隆放入一个试管，每管加入对应抗性LB培养基4ml，该培养基中含氨苄青霉素100mg/ml，37℃、250rpm摇床过夜；将菌液做质粒抽提，并进行双酶切鉴定，确认构建的载体pLenti6.3/V5‑GW/Em‑GFP VerA‑L‑ASPase II准确；所述过夜是指12h；Ⅱ.使用293T细胞包装生成高滴度的含L‑ASPase II的病毒颗粒；Ⅲ.使用病毒颗粒转染诱导性多能干细胞；2)体外诱导诱导性多能干细胞生成含L‑ASPase II的红细胞：Ⅰ.IPS细胞体外分化诱导成红细胞体EB；Ⅱ.EB诱导分化成成熟红细胞；所述步骤2)Ⅰ具体为：传代12～30代的人的IPS细胞使用胶原蛋白酶IV消化后，转移到由IMDM为基础培养液配制的培养液中，培养液中含SCF 100ng/mL，TPO 100ng/mL,FLT3配体100ng/mL,BMP4 10ng/mL,VEGF‑A165 5ng/mL,IL‑3 5ng/mL,IL‑6 5ng/mL以及促红细胞生成素EPO 3U/mL；细胞置于37℃，5％CO2条件下培养20天形成EB；形成EB后，用胶原蛋白酶B在37℃消化30分钟后细胞置于缓冲液中10分钟；所述步骤2)Ⅱ具体为：①消化后EB细胞以5×105/ml铺瓶，培养液以IMDM培养基为基础培养基配制，培养液中含EPO 3～6U/ml，INSULIN 50～100ng/ml，SCF 50～100ng/ml，DEX 5～10μM，IL‑35ng/ml，Heparin 2U/ml以及Transferrin 50μg/ml；置37℃、5％CO2条件下培养；②培养至第4天，细胞由培养瓶以1×105/ml转入培养袋，培养液以IMDM培养基为基础培养基配制，培养液中含EPO 3～6U/ml，INSULIN 50～100ng/ml，SCF 50～100ng/ml，DEX 5～10μM，IL～3 5ng/ml以及Heparin 2U/ml，置37℃、5％CO2条件下培养；③培养至第8天，细胞培养液以IMDM培养基为基础培养基配制，培养液中含EPO 3～6U/ml，SCF 50～100ng/ml，DEX 5～10μM以及Heparin 2U/ml；④培养至第11天，换用以IMDM培养基为基础培养基配制的培养液，培养液中含DEX 5～10μM和Heparin 2U/ml，细胞密度调整为2×106/ml；⑤培养至25天，收集终产物，即为含L‑ASPase II的药物红细胞。