[发明专利]体外诱导生成含L‑ASPaseII的红细胞药物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种使用慢病毒载体系统改造诱导性多能干细胞（IPS细胞）并将其在体外诱导生成含L-天冬酰胺酶II药物红细胞的方法，属于再生医学领域。

背景技术

L-天门冬酰胺是某些肿瘤细胞生长必不可少的氨基酸,对人体正常细胞而言,自身具有合成L-天门冬酰胺的能力,而肿瘤细胞缺乏天门冬酰胺合成酶不能合成天门冬酰胺，其细胞需要从外源的L-天门冬酰胺摄取才能存活。L-天门冬酰胺酶II(L-asparaginase,L-ASPase II)能催化水解L-天门冬酰胺生成L-天门冬氨酸和氨,因此能够有效地抑制癌细胞的生长,最终使癌细胞消亡。所以L-ASPase II是治疗肿瘤的一种重要药物，尤其对急性淋巴细胞白血病(Actute lymphoblastic leukemia,ALL)和非何杰淋巴瘤(NHL)有较好疗效。虽然L-ASPase II在临床应用中有较好的疗效，但L-ASPase II在临床应用过程会产生严重的毒副作用,引起过敏、急性胰腺炎、糖尿病、高血糖及血液系统异常等甚至危及生命的严重不良反应，这些毒副作用限制了L-ASPase II在临床的应用。目前如何减少L-ASPase II的毒副作用是临床使用面临的一个重要难题。

红细胞是血液中数量最多的血细胞，它具有极大的变形能力，可使其顺利通过比自身直径还小的毛细血管。研究表明，当红细胞处于轻度低渗(约为血浆渗透压的1/2)的环境中，外界水分可进入红细胞使之发生可逆性膨胀154%～174%，变为椭圆形，当达到溶血临界点时，红细胞膜上一些直径20～50nm的孔隙将短暂开放，外界多肽、蛋白质、酶及药物等均可通过这些孔道进入红细胞腔内。而当红细胞周围环境恢复等渗状态时，红细胞又可缩小恢复原状，膜上孔道亦随之收缩，红细胞的这些特性决定了可以将特定药物包封于红细胞内。此外，红细胞作为药物载体还有合成药物载体无法比拟的优势：1）理想的生物相容性及生物降解性；2）降低外源物质的免疫原性；3）提高药物在体内的稳定性。研究表明，使用红细胞来包埋L-ASPase II可以有效延长L-ASPase II在体内半衰期，减少L-ASPase II用量，增加药物靶向性，从而能够有效降低L-ASPase II的毒副作用。

虽然红细胞药物的研究取得了巨大的进展，但目前生产红细胞药物基本上采用的都是以改变渗透压为基础的制备方法，包括早期的低渗溶血法（hypotonic hemolysis）、低渗稀释法（hypotonic dilution）以及改良后的低渗透析法（hypotonic dialysis）和低渗预涨法（hypotonic preswelling），以上方法都是通过改变渗透压而改变红细胞膜的通透性从而起到包埋药物的目的。改变红细胞膜通透性包埋药物存在如下几个问题：1）载体红细胞存在不同程度的变形性降低；2）载体红细胞存在不同程度膜损伤；3）载体红细胞存在不同程度的形态异常；4）载体红细胞脆性增大；以上这些改变会直接影响载药红细胞在体内的清除时间和药物释放效果。迫切需要生产一种既能够发挥红细胞药物载体优势又能保持红细胞形态功能基本正常的红细胞药物是该领域研究的主要方向之一。

诱导性多能干细胞（IPS细胞）作为一种无限来源的体外多能干细胞，业已证明在体外能够生成形态功能正常的红细胞，我们通过对IPS细胞使用慢病毒载体系统进行基因改造，并将之在体外诱导生成含有L-ASPase II的红细胞，生成的红细胞既能够作为L-ASPase II的缓释载体使用，又能够保持红细胞原有的形态功能，进一步降低了L-ASPase II的毒副作用，为今后的临床应用打下坚实的基础。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种使用慢病毒载体系统改造诱导性多能干细胞（IPS细胞）并将其在体外诱导生成含L-ASPase II的红细胞药物的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

体外诱导生成含L-ASPase II的红细胞药物的方法，包括以下步骤：

1）使用慢病毒载体系统改造诱导性多能干细胞（IPS细胞）：

Ⅰ.构建pLenti6.3/V5-GW/Em-GFP VerA-L-ASPase II质粒；

Ⅱ.使用293T细胞包装生成高滴度的含L-ASPase II的病毒颗粒；

Ⅲ.使用病毒颗粒转染诱导性多能干细胞（IPS细胞）；

2）体外诱导诱导性多能干细胞（IPS细胞）生成含L-ASPase II的红细胞：