[发明专利]重组质粒pFastdual-polh-da26-Asp、家蚕杆状重组病毒及利用该病毒生产L-天冬酰胺酶Ⅱ的方法

摘要

本发明涉及利用杆状病毒重组系统在家蚕细胞及家蚕体内融合表达大肠杆菌天冬酰胺酶的方法。本发明将da26和Asp以相同酶切位点的核苷酸连接构建成融合基因，将其克隆至含有双启动子的pFastdual载体，同时将polh克隆至多角体启动子下形成新的重组质粒。通过转移载体同源重组，形成含有da26和Asp融合表达的重组Bacmid，通过转染家蚕细胞后获得重组病毒。da26表达的BV/ODV-E26是来源于BmNPV的一种包膜蛋白，可以与外源基因表达的蛋白紧密结合，通过超声裂解和差速离心法将外源蛋白分离纯化。这种表达系统不仅可以获得更多的Asp，而且由于BV/ODV-E26可以吸附在BmNPV形成的多角体颗粒的表面，通过离心纯化多角体后，就可以获得融合表达产物da26-Asp，再通过洗脱，把融合蛋白洗脱下来，简化了纯化的流程。

主权项

1.重组质粒pFastdual-polh-da26-Asp，其特征在于它是通过以下方法制备的：（1）以家蚕杆状病毒DNA为模板，SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示序列分别为上下游引物，通过PCR扩增反应，制得扩增产物da26；以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示序列为上下游引物，通过PCR扩增反应，制得扩增产物Asp；（2）扩增产物da26及Asp琼脂糖凝胶电泳，回收纯化后用XbaⅠ做单酶切，然后将da26、asp酶切产物纯化并连接，得到da26-Asp连接产物；（3）以da26-Asp连接产物为模板，以SEQIDNo.1和SEQIDNo.4分别为上游引物进行PCR扩增，得扩增产物da26-Asp；（4）扩增产物da26-Asp与质粒pMD18-T做连接，得到重组质粒pMD18-T-da26-Asp；（5）以BmNPVDNA为模板，SEQIDNo.5和SEQIDNo.6为上下游引物，通过扩增BmNPV多角体基因的读码框，扩增的片段用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，克隆至杆状病毒的p-polh、p-10双启动子转移载体pFastdual质粒的多角体启动子p-polh下，得到重组质粒pFastdual-polh；（6）测序正确的重组质粒pMD18-T-da26-Asp以SmaⅠ和SphⅠ双酶切，克隆至重组质粒pFastdual-polh的p-p10启动子下，得到重组质粒pFastdual-polh-da26-Asp；各引物序列如下：SEQIDNo.1：TCCCCCGGGATGAATTCTGTTCACACG；SEQIDNo.2：GCTCTAGAGCAATAGGCGTTAATATCACTTTG；SEQIDNo.3：GCTCTAGAGCCCATCACCATCACCATCAC；SEQIDNo.4：ACATGCATGCTTAGTACTGATTGAAGATCTGCT；SEQIDNo.5：GCGGATCCATGCCGAATTATTCATACA；SEQIDNo.6：ACATGAATTCTTAATACGCCGGACCAGT。