[发明专利]一种大鼠CYP450酶质谱绝对定量方法

摘要

本发明的大鼠CYP450酶亚型质谱绝对定量方法，属于蛋白质组学技术领域。本发明基于LC/MS/MS技术，利用CYP450酶经胰酶水解产生的特异性肽段对酶进行定量的策略，实现了同时对大鼠肝微粒体等体系中5种CYP450酶亚型CYP2D3、CYP2C70、CYP2A1、CYP2D26、CYP2B2的绝对定量。本发明主要包括如下步骤：蛋白样品的预处理、标准曲线的制备、质控样品的制备以及蛋白样品的测定。本发明的方法线性关系良好、准确度高、重现性好而且灵敏、精密、可靠，可用于新药开发、药物代谢研究及药物相互作用的评价。

主权项

1.一种大鼠CYP450酶质谱绝对定量方法，涉及5种CYP450酶亚型CYP2D3、CYP2C70、CYP2A1、CYP2D26、CYP2B2；过程有蛋白样品预处理，标准曲线制备，最后进行蛋白样品中CYP450酶亚型含量测定；所述的蛋白样品预处理，有如下5步骤，（1）蛋白样品的还原，于聚乙烯管中加入100μL大鼠肝微粒体样品；加入50mg固体变性剂，涡流溶解混匀，所述的固体变性剂，是尿素；加入10μL pH缓冲液，涡流混匀，所述的pH缓冲液，是500mM的碳酸氢氨溶液；加入4μL还原剂，涡流混匀，所述的还原剂，是300mM的二硫苏糖醇溶液；37℃孵育1小时，得到反应液；（2）半胱氨酸的封闭，于反应液中加入12μL半胱氨酸封闭剂，涡流混匀；室温孵育40min；所述的半胱氨酸封闭剂，是300mM的碘乙酰胺溶液；（3）肝微粒体样品的胰酶消化，经半胱氨酸封闭的反应液中加入400μL消化缓冲液，再加入20μL胰酶溶液，涡流混合，37℃孵育12~16h得到肝微粒体样品反应液，后13000g离心5min得肝微粒体样品酶解反应上清溶液；所述的消化缓冲液，是50mM的碳酸氢氨溶液；所述的胰酶溶液，是0.5mg/mL的胰酶溶液；（4）肝微粒体样品酶解反应液的固相萃取，于固相萃取柱中加入1mL甲醇溶液，至液体自然流完；于固相萃取柱中加入1mL洗脱溶液，至液体自然流完；于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液体自然流完，两遍洗；取肝微粒体样品酶解反应上清溶液，至液体自然流完；于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液体自然流完，三遍洗；于固相萃取柱中加入1mL洗脱溶液，至液体自然流完，得肝微粒体样品洗脱液，置于聚乙烯管中；所述的洗脱溶液，是按体积比乙腈/水/三氟乙酸=80/20/0.1的溶液，所述的淋洗溶液，是按体积比水/三氟乙酸=100/0.1的溶液；（5）肝微粒体样品洗脱液的浓缩、复溶，将肝微粒体样品洗脱液真空离心蒸干，加入100μL去离子水，涡流混匀，得到肝微粒体样品复溶液；所述的标准曲线制备，是利用去离子水将特异性肽段标准品溶解至5μg/μL，得到特异性肽段储备液；利用去离子水将特异性肽段储备液分别稀释至50、100、300、1000、3000、10000pg/μL；取20μL进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，以特异性肽段浓度为横坐标，特异性肽段峰面积为纵坐标，用加权W=1/x²最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线；所述的蛋白样品中CYP450酶亚型含量测定，是取肝微粒体样品复溶液20μL进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，将肽段峰面积代入标准曲线，求得肽段浓度，此肽段浓度即为对应CYP450酶亚型浓度；经样品蛋白浓度校正，即将CYP450酶亚型浓度除以蛋白浓度，得到蛋白样品中CYP450酶亚型含量；在标准曲线制备及蛋白样品中CYP450酶亚型含量测定过程中，色谱条件为：LC-20ADXR SHIMADZU型液相色谱系统；色谱柱：peptide C18柱，50mm×2.1mm I.D.，5μm粒径；流动相：甲酸体积百分数占0.1%的水和甲酸体积百分数占0.1%的乙腈，梯度洗脱；柱温40℃；流速0.5mL/min；进样量20μL；所述的梯度洗脱程序，过程如下表所示：其中A是甲酸体积百分数占0.1%的水溶液，B是甲酸体积百分数占0.1%的乙腈混合溶液；质谱条件为：Qtrap 5500型线性离子阱液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子化源和AnaLyst 1.5数据处理软件；离子源：电喷雾离子化源；正离子方式检测；离子喷射电压5000V；温度500℃；源内气体1：氮气压力45psi；气体2：氮气压力45psi；气帘气体：氮气压力25psi；扫描方式为多重反应监测。