[发明专利]一种利用传代鸡胚成纤维细胞制备传染性法氏囊病毒活疫苗的方法

摘要

本发明涉及一种利用传代鸡胚成纤维细胞制备传染性法氏囊病毒活疫苗的方法。本发明依次经过生产用毒种制备、制苗材料制备、IBDV细胞病毒液制备、成品检验、配苗及分装、冻干等步骤制得IBDV活疫苗，本发明从接种材料、培养液改良、培养环境维护、冻干保护剂组分等方面，对现有的生产方法进行了改良，独创了新的传代细胞培养方法。此外，还包括通过本发明方法制得的IBDV活疫苗在预防鸡传染性法氏囊病中的应用。由本发明方法制备得到的IBDV活疫苗具有耐热性能好，病毒滴度高，稳定性好，适合进行大规模疫苗生产的特点。

主权项

一种利用传代鸡胚成纤维细胞制备传染性法氏囊病毒活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）生产用毒种制备①毒种繁殖将传染性法氏囊病毒毒种用灭菌生理盐水作103～104倍稀释后，接种单层鸡胚成纤维细胞；弃掉细胞培养液，按培养液体积的1/10接毒，37℃吸附1小时，加入培养液，并向其添加1%体积的10%还原型谷胱甘肽溶液；37℃，5%CO2条件下，培养3～4天，待80%细胞出现特异性病变时收获病毒液；于‑20℃冰柜中反复冻融3次，收获于灭菌容器内，‑20℃保存；②毒种鉴定符合生产用种子标准；③毒种保存在‑20℃以下保存，不超过9个月；④毒种继代不超过3代；（2）传代细胞的制备取9～10日龄SPF鸡胚，制备鸡胚成纤维细胞，37℃培养，待细胞长成单层后，用质量分数为0.2%的胰酶溶液进行消化，加入原体积2倍的含10%初生牛血清的DMEM，吹打均匀，再取原体积细胞液至另外细胞培养瓶中培养，直至长成单层，传代培养，传代次数不超过5代；（3）传染性法氏囊病毒病毒液的制备①接种弃掉细胞培养液，取生产用种毒，用灭菌生理盐水作103～104倍稀释，按培养液体积的1/10接种传代培养后的单层鸡胚成纤维细胞；37℃吸附1小时，加入培养液，并向其中添加1%体积的10%还原型谷胱甘肽溶液，轻轻混匀，37℃培养；②培养病毒接种24小时后，每6小时向培养液中加入总体积0.2%的0.5mol/LNaHCO3，培养3～4天，待80%细胞出现特异性病变时收获病毒液；③病毒液收获将装有病毒液的培养瓶，放入‑20℃冰柜中反复冻融3次，收获于灭菌容器内，在‑15℃以下保存，应不超过1个月；（4）半成品检验①无菌检验每组病毒液分别取样，应无菌生长；②病毒含量测定每0.2ml病毒含量应为105.5EID50，方可配苗；（5）配苗及分装①冻干保护剂的制备A液：明胶5g、蔗糖5g、糊精5g、胰蛋白胨2g，去离子水定容至100ml，116℃，高压灭菌30min，15℃保存，不超过7天；B液：维生素C0.1g、山梨醇2g、谷氨酸钠1.5g，去离子水定容至100ml，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存，不超过3天；②分装将保护剂A液、B液按1︰1体积混合均匀，将检验合格的细胞病毒液，按1︰1体积比加入保护剂中，定量分装；（6）冻干分装后迅速进行冷冻真空干燥。