[发明专利]一种改进左旋多巴生物合成的方法

摘要

本发明公开了一种改进左旋多巴生物合成的方法，包括如下步骤：（1）以SEQ ID No.1、2为引物，以E.coli BL21菌株为模板，扩增，回收得到hpaBC基因片段，双酶切pCDFDuet-1质粒和hpaBC基因片段，连接，制成重组质粒pBET1；（2）将重组质粒pBET1导入到宿主大肠杆菌得到转化宿主细胞；（3）将转化宿主细胞经筛选，得到左旋多巴生产工程菌单菌落，取1ml放入100ml第一种培养基中，培养，测定OD600，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷水溶液，抗坏血酸，继续培养，测定左旋多巴含量；本发明的方法，提高了左旋多巴的产量，且降低了生产成本，简化了操作工艺。

主权项

一种改进左旋多巴生物合成的方法，其特征包括如下步骤：（1）以序列表SEQ ID No.1、SEQ ID No.2为PCR引物，以E.coli BL21菌株为模板，扩增，回收得到用序列表SEQ ID No.3所示的hpsBC基因片段，用BamH I和Hind Ⅲ双酶切pCDFDuet‑1质粒和hpaBC基因片段，再用T4连接酶，进行连接反应，制成重组质粒pBET1；（2）将重组质粒pBET1导入到宿主大肠杆菌BL21（DE3）感受态得到转化宿主细胞；（3）用下述两种方法之一进行：第一种：将转化宿主细胞经平板筛选，得到左旋多巴生产工程菌单菌落，将获得的左旋多巴生产工程菌菌种活化后取1ml放入100ml第一种培养基中培养，在OD600为0.5，加入1mL的1mmol/L的异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷水溶液，同时加入抗坏血酸，使抗坏血酸的浓度为0.5‑2.75g/L，继续培养24小时，测定左旋多巴含量；第二种：将转化宿主细胞经平板筛选，得到左旋多巴生产工程菌单菌落，将获得的左旋多巴生产工程菌菌种活化后取1ml放入100ml LB培养基中培养，在OD600为0.5，加入1mL的1mmol/L的异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷水溶液，培养3小时，用5000r/min离心5分钟，再悬浮于100ml第二种培养基中培养，在OD600为20，加入L‑酪氨酸，使浓度为400mg/L，同时加入抗坏血酸，使抗坏血酸的浓度为0.5‑2.75g/L，继续培养24小时，测定左旋多巴含量；第一种培养基配方为：蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，酵母浸粉5g/L，L‑酪氨酸400mg/L，链霉素30mg/L，蒸馏水定容，pH=7.0，高压蒸汽灭菌，121℃，20min；第二种培养基配方为：蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，酵母浸粉5g/L，链霉素30mg/L，蒸馏水定容，pH=7.0，高压蒸汽灭菌，121℃，20min。