[发明专利]一种改进左旋多巴生物合成的方法

说明书

技术领域

本发明所属生物医药技术领域，涉及左旋多巴的生产方法，特别是涉及一种左旋多巴生物合成的方法。

背景技术

帕金森症（Parkinson's disease）又称“震颤麻痹”，是严重危害人类健康的神经性疾病，其症状表现为静止时颤抖，中枢性的持续性肌肉紧张，导致肌肉疼痛或是身体无法伸直，运动不能和动作迟缓。病人常因缺乏平衡感而跌倒，产生不自主的情绪反应或肢体动作。据统计60岁以下的普通人群中帕金森症的发病率为0.1%，60岁以上老人的发病率为1%，80岁以上的发病率为2%。帕金森症目前已成为仅次于肿瘤和心脑血管疾病的严重危害老年人身体健康的致残性疾病。

40多年来，左旋多巴（L-dopa），其化学名称为3,4-二羟基苯丙氨酸（3,4-dihydroxylphenylalanine），是最主要的、最有效的用于治疗帕金森症的药物，它穿过血脑屏障，在大脑中代谢为多巴胺，抑制过量乙酰胆碱的作用，疗效显著。全球主要的七个市场（美国、日本、法国、德国、意大利、西班牙和英国）中，左旋多巴最大市场美国，预计到2019年销售额达到6.99亿美元。欧洲市场，德国最高预计达5.85亿美元，法国最大预计达1.77亿美元。据统计目前我国的帕金森症患者有近250万人，且以每年10万的病患人数增加。因此国内外对左旋多巴有巨大的需求空间。

左旋多巴的生产有化学合成、从天然植物中提取以及用微生物酶转化三种主要方法。1913年Marcus从蚕豆籽苗种豆荚中提取天然左旋多巴，国内于1972年从豆科植物藜豆种子中提取左旋多巴。1974年商品化的左旋多巴投放市场，应用于临床医疗。从植物中提取左旋多巴由于受到原料来源的限制，产量小，远不能满足市场需求。而化学合成法制备的多巴是外消旋体，分离得到单一L-型对映体存在困难。

1970年代人们开始利用弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）和草生欧文氏菌（Erwinia herbicola）中的酪氨酸酚解酶（tyrosine phenol-lyase）的可逆反应，以丙酮酸、原儿茶醛和氨为底物，通过微生物酶法合成左旋多巴。从1993年开始，日本味之素公司就是采用弗氏柠檬酸杆菌，通过流加底物和较低温度发酵，生产左旋多巴。1990年代后人们开始运用基因工程的手段生产多巴。1998年韩国Park H-S等人构建了多巴合成途径，包括甲苯双氧化酶基因、二氢二醇脱氢酶基因和酪氨酸酚解酶基因表达载体，利用苯为原料，在铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)和大肠杆菌中合成左旋多巴分别为3mM和14mM。由于邻苯二酚积累的原料苯对微生物细胞有毒性，而且邻苯二酚容易自氧化，工艺控制难而受到限制。2009年土耳其的Kurt等人利用透明颤菌血红蛋白作为细胞反应中的氧供载体，把血红蛋白基因导入弗氏柠檬酸杆菌和草生欧文氏菌中，在酪氨酸酚解酶催化下，把酪氨酸转化为多巴的产量分别为112mg/L和97mg/L。

4-羟基苯乙酸-3-羟化酶基因(hpaBC)是大肠杆菌苯酚降解途径中的基因，具有较广泛的底物羟化活性。2011年墨西哥Munoz等人优化了以葡萄糖为前体物合成酪氨酸的生物路线，构建了包含hpaBC基因的重组质粒，高密度细胞转化酪氨酸，摇瓶左旋多巴产量320mg/L。

但现有技术的方法存在收率较低、生产成本高，操作工艺较复杂的不足。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，通过构建重组工程菌株，提供一种改进左旋多巴生物合成的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种改进左旋多巴生物合成的方法，包括如下步骤：

（1）以序列表SEQ ID No.1、SEQ ID No.2为PCR引物，以E.coli BL21菌株为模板，扩增，回收得到用序列表SEQ ID No.3所示的hpaBC基因片段，用BamH I和Hind Ⅲ双酶切pCDFDuet-1质粒和hpaBC基因片段，再用T4连接酶，进行连接反应，制成重组质粒pBET1；

（2）将重组质粒pBET1导入到宿主大肠杆菌BL21（DE3）感受态得到转化宿主细胞；

（3）用下述两种方法之一进行：