[发明专利]一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法及螺旋结构DNA序列

摘要

本发明公开了一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法及螺旋结构DNA序列，属于基因工程领域。该方法的步骤为：（1）CRISPR/Cas9和嵌合RNA的设计与构建；（2）Cas9mRNA体内翻译后形成Cas9核酸酶与嵌合RNA结合，实现定点剪切，剪切后产生DNA双链断裂，通过诱导细胞自身天然的DNA修复过程“非同源末端连接”来引入外源DNA，从而修改细胞内源基因。该方法步骤简单，识别位点灵活且消耗低。

主权项

一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法，其步骤为：（1）CRISPR/Cas9和嵌合RNA的设计与构建1）优化编码Cas9的密码子2）Cas9核酸酶载体构建和Cas9核酸酶mRNA 合成根据步骤1）优化后的序列，定制合成编码Cas9核酸酶的DNA序列，并将其分别插入到如下表达载体中形成：pST1374‑Cas9、pST1374‑NLS‑Flag‑Cas9；利用Cas9 C‑NLS Cla For 和Cas9 C‑NLS Apa Rev两个引物，通过链式聚合酶反应扩增一个DNA片段，使用ClaI和 ApaI两个限制性内切酶消化扩增的DNA片段和pST1374‑NLS‑Flag‑Cas9，将扩增的DNA片段插入到pST1374‑NLS‑Flag‑Cas9，构建pST1374‑NLS‑Flag‑Cas9‑NLS载体；编码三个细胞核定位信号NLS的序列是利用Cas9‑N‑3NLS For 和Cas9‑N‑3NLS Rev 引物以寡核苷酸为模板PCR扩增出来的，PCR 产物经NheI和 NotI 两个限制性内切酶消化后，再由同样的酶切位点插入到pST1374‑NLS‑Flag‑Cas9载体中，构建pST1374‑3XNLS‑Flag‑Cas9；螺旋结构DNA序列经定制合成后插入到编码标签蛋白Flag的序列和编码Cas9核酸酶序列中间，形成pST1374‑NLS‑Flag‑Helix‑Cas9载体；Cas9核酸酶系列载体经AgeI线性化后，利用T7 Ultra Kit 体外转录后得到Cas9核酸酶mRNA，直接用于基因打靶；3）嵌合RNA 的合成嵌合RNA模板上的T7启动子序列，是以合成的寡核苷酸为模板通过链式聚合酶反应产生，利用T7 Shortscript Kit 体外转录出嵌合RNA；（2）Cas9mRNA体内翻译后形成Cas9核酸酶与嵌合RNA结合，实现定点剪切，剪切后产生DNA双链断裂，通过诱导细胞自身天然的DNA修复过程“非同源末端连接”来引入外源DNA，从而修改细胞内源基因。