[发明专利]一种随机shRNA文库的构建方法

摘要

创建了一种基于pLKO.1慢病毒载体的随机shRNA文库构建方法，其方法为：合成特征性核酸序列(自5’到3’依次为21任意核酸、由Xho1酶切位点形成互补链的小茎环结构)，将其退火后补平成完全的发夹结构，通过连接反应加入shRNA表达所需终止序列和克隆所需3，端酶切位点EcoR1，在此基础上通过DNA聚合酶和单条引物产生其互补链，并再次通过连接反应，给新生成的链的3’端连接上酶切位点Age1；通过PCR的方法扩增同时含有Age1和EcoR1的序列；然后将PCR产物连入pMD-18 simple T载体，再用Xho1酶切后自连的方法，去除shRNA内部额外的序列，最后将插入片段亚克隆至pLKO.1载体中，构建表达完全随机的shRNA文库，并包装成病毒。该文库在筛选致病基因和药物靶点方面具有广阔的应用前景。

主权项

一种随机shRNA文库的构建方法，其特征在于：通过合成特征性核酸序列(自5’到3’依次为21任意核酸、由Xho1酶切位点形成互补链的小茎环结构)，通过聚合、连接反应形成含有酶切位点和完全随机的shRNA的双链DNA结构，克隆至T载体，再用Xho1酶切后自连的方法，去除shRNA内部额外的序列，最后通过Age1和EcoR1酶切回收T载体中插入片段，亚克隆至pLKO.1载体中，构建表达完全随机的shRNA的pLKO.1质粒文库。