[发明专利]一种模拟重组无痕克隆方法

摘要

本发明涉及一种模拟重组无痕克隆方法，所述方法是设计载体引物时，在引物的5’末端要分别增加与目的基因序列相同的一段DNA碱基，所得载体DNA末端和目的基因内部具有匹配区域，再将载体DNA和目的基因混合，先后用λ Exonuclease和T4 DNA聚合酶处理，获得重组DNA。本发明的有益效果主要体现在：（1）不需要经PCR扩增目的基因，减少了PCR引起的突变；（2）可以从DNA混合物中特异性地克隆目的片段；（3）不留酶切位点的痕迹。

主权项

一种模拟重组无痕克隆方法，所述方法包括：（1）载体DNA制备：以克隆载体质粒为模板，以目的基因插入位点两端的序列为结合位点设计引物，并在引物5’端分别加上与目的基因匹配的长度为20~30bp的序列，所得上游引物记为primer1，下游引物记为primer2，以primer1和primer2为引物进行PCR扩增获得载体DNA； （2）目的基因制备：经酶切或扩增获得包含目的基因的片段；（3）基因重组：将步骤（1）载体DNA和步骤（2）所得片段混合，先加入λ Exonuclease，37℃反应30 min ，72℃温浴5min ，50℃温浴30min，然后温度降至37℃，加入 T4 DNA聚合酶和dNTPs，37℃反应15 min，获得重组DNA。