[发明专利]一种原生质体转化选育高产亮氨酸氨肽酶菌株的方法

摘要

一种原生质体转化选育高产亮氨酸氨肽酶菌株的方法，属于酶制剂、食品添加剂技术领域。本发明利用原生质体转化技术将重组质粒PMA-BSAP与从枯草芽孢杆菌Zj016所制备的原生质体混合于高渗缓冲液中，在PEG介导下，使原生质体与PMA-BSAP发生相互凝聚，进行遗传转化，适宜的条件下再生细胞壁，成功获得一株重组转化菌ZH-Zj016，该重组转化菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.6559；传代多次实验证明该重组转化菌的遗传性能稳定。初步优化该重组转化菌的摇瓶培养基成分及发酵条件后，重组转化菌ZH-Zj016发酵产亮氨酸氨肽酶酶活为161U/mL，达原始菌株的23倍。

主权项

一种原生质体转化选育高产亮氨酸氨肽酶菌株的方法，其特征在于：（1）转化：利用原生质体转化技术，将8×109个/mL的枯草芽孢杆菌Zj016原生质体悬液500 μL，依次加入20 μL 0.1μg/μL的质粒PMA‑BSAP及20 μL的高渗缓冲液SMM，用枪头轻轻吹吸混匀；再加入1.5 mL融合剂，轻轻颠倒混匀后，37℃、80r/min处理5min，2000 r/min离心10 min；用SMM洗涤2次后重悬；所述高渗缓冲液SMM以mol/L计为：蔗糖0.5，顺丁烯二酸0.02，MgCl2 0.02，用去离子水配制，调pH为7.0；所述融合剂为：40% PEG6000，用SMM液配制，调pH为7.0；（2）再生：将步骤（1）所得重悬液稀释涂布于转化子再生培养基中，37℃培养24 h，得转化子；所述转化子再生培养基以g/L计为：蛋白胨 10，牛肉膏 5，酪蛋白氨基酸水解物 5，葡萄糖 6，氯化钠 1.2，琼脂 20,卡那霉素 0.05，用SMM溶液配制，pH 7.2；（3）筛选：挑选步骤（2）所得转化子划线涂布于高产菌株筛选培养基，成功选育获得高产亮氨酸氨肽酶菌株；所述高产菌株筛选培养基以g/L计为：可溶性淀粉6，豆粕18，酵母膏24，甘油2.5，K2HPO4· 3H2O 6，CoCl2 0.015，L‑亮氨酸‑4‑硝基苯胺 0.5，卡那霉素 0.05，琼脂 20，用去离子水配制，pH 8.0。