[发明专利]利用双链RNA干扰技术制备降低烟草烟碱合成的抑制剂的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种利用双链RNA干扰技术制备降低烟草烟碱合成的抑制剂的方法及其应用，该方法先提取烟草的RNA，反转录得到烟草腐胺-N-甲基转移酶(PMT)基因的cDNA；然后利用PCR技术扩增该基因cDNA中的片断；然后连接在可表达RNA的质粒载体PET-21a中；将该质粒转入缺失RNAE3酶的大肠杆菌细胞中，表达发卡dsRNA；破碎细胞，得到dsRNA粗制剂，向dsRNA粗制剂中依次加入甘油、保护剂和分散剂，即可得到降低烟草烟碱合成的抑制剂。将得到抑制剂以5~15mL/株施于烟草上，降低烟草烟碱合成。本发明生产简便、成本低廉、对人畜和高等动物无害，适于在烟草上大量施用，具有广阔的产业化前景。

主权项

一种利用双链RNA干扰技术制备降低烟草烟碱合成的抑制剂的方法，它包括以下步骤：1）提取烟草的RNA，反转录得到烟草腐胺‑N‑甲基转移酶基因的cDNA；2）利用PCR技术，以烟草腐胺‑N‑甲基转移酶基因的cDNA为模板，得到的烟草腐胺‑N‑甲基转移酶基因片断；3）将步骤2）中烟草腐胺‑N‑甲基转移酶基因片断连接到T载体上；4）将步骤3）中T载体上烟草腐胺‑N‑甲基转移酶基因片断连接到质粒载体PET‑21a上，得到重组质粒PET‑EH；5）将步骤4）中得到重组质粒PET‑EH转入到缺失RNAE3酶的大肠杆菌细胞中，6）将步骤5）中大肠杆菌细胞进行筛选，等到转化子；7）将步骤6）中转化子在LB液体培养基中扩大培养；8）将扩大培养的转化子采用超声波破碎，得到含有发卡dsRNA的破碎细胞溶液，即为dsRNA粗制剂；9）向步骤8）中dsRNA粗制剂中依次加入与dsRNA粗制剂溶液重量比为2~5%的甘油、0.01~0.1%的色氨酸和1~2%的聚乙二醇醚，然后搅拌均匀后分装，即可得到降低烟草烟碱合成的抑制剂，所述抑制剂中dsRNA浓度为25~40μg/mL。