[发明专利]利用pFast Bac Dual杆状病毒表达PCV 2 Cap蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种利用pFast Bac Dual杆状病毒表达PCV2Cap蛋白的方法，该方法包括以下步骤：扩增带有His标签的编码PCV 2 Cap蛋白的基因片段；将上述基因片段连接到pFast Bac Dual质粒上，获得重组转移质粒pFast Bac-p10-ORF2-pH-ORF2；将重组转移质粒转化大肠杆菌DH10Bac，经蓝白斑筛选后得到重组穿梭载体Bac-p10-ORF2-pH-ORF2；将重组穿梭载体转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒Ac.Dual-Cap；将重组杆状病毒接毒于昆虫细胞，培养后收集昆虫细胞，将表达产物纯化后得到重组Cap蛋白。本发明方法解决了Cap蛋白在真核细胞中表达量低的难题。本发明方法重组的Cap蛋白设计有His标签，利于其后续的纯化，并且其生物活性优于原核表达系统所表达的Cap蛋白，可以应用于流行病学诊断方法的建立及PCV2亚单位疫苗的研发。

主权项

一种利用pFast Bac Dual杆状病毒表达PCV2Cap蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）抽提PCV2病毒的DNA；根据PCV2ORF2的序列设计引物，扩增得到带有His标签的编码PCV2Cap蛋白的基因片段；（2）将步骤（1）扩增得到的基因片段连接到pFast Bac Dual质粒上，获得重组转移质粒pFast Bac‑p10‑ORF2‑pH‑ORF2；（3）将重组转移质粒pFast Bac‑p10‑ORF2‑pH‑ORF2转化大肠杆菌DH10Bac，发生转座作用，经蓝白斑筛选后得到含有ORF2基因的重组穿梭载体Bac‑p10‑ORF2‑pH‑ORF2；（4）以脂质体介导的方法将重组穿梭载体Bac‑p10‑ORF2‑pH‑ORF2转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒Ac.Dual‑Cap；（5）将重组杆状病毒Ac.Dual‑Cap接毒于昆虫细胞，培养后收集昆虫细胞，重组Cap蛋白在昆虫细胞的细胞核和细胞质中获得表达；将表达产物纯化后得到重组Cap蛋白；步骤（1）所述引物的序列为：P10F：5’–CCATGGATGCACCACCATCATCACCACACGTATCCAAGGAGGCGTTT‑3’；P10R：5’‑TGCAGGTACCTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCT‑3’；PHF：5’‑GGATCCATGCACCACCATCATCACCACACGTATCCAAGGAGGCGTTT‑3’；PHR：5’‑CGCAAGCTTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTT‑3’；步骤（5）所述的纯化是用NI‑NTA树脂纯化。