[发明专利]一种利用人体废弃胚胎建立人胚胎干细胞系的方法

摘要

本发明涉及一种利用人废弃胚胎建立人胚胎干细胞系的方法，可有效解决现有人胚胎干细胞的建立方法操作复杂，需要大量的胚胎，成本高，成功率低，人胚胎干细胞系远不能满足应用的需要的问题。解决的技术方案是，收集并培养废弃胚胎，分别制备小鼠胚胎成纤维细胞和小儿包皮成纤维细胞，按照0.55~0.65×105个/cm2的密度，混合上述细胞制备成混合饲养层，采用机械法分离废弃胚胎的内细胞团，将分离的内细胞团置于混合饲养层上培养，建立人胚胎干细胞系。本发明操作简单，可以有效利用临床上大量废弃的新鲜及冷冻胚胎，并利用最佳铺皿密度，节约了饲养层细胞，大大降低了建立胚胎干细胞系的成本，为将来开发利用胚胎干细胞奠定了基础。

主权项

一种利用人废弃胚胎建立人胚胎干细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）收集并培养废弃胚胎：收集新鲜的废弃胚胎或对冷冻的胚胎进行解冻，按照常规方法进行培养；（2）饲养层细胞的制备：按照常规方法分别制备小鼠胚胎成纤维细胞和小儿包皮成纤维细胞；（3）混合饲养层的制备：分别收集步骤（2）中制备的小鼠胚胎成纤维细胞和小儿包皮成纤维细胞，分别经磷酸缓冲液漂洗，丝裂霉素C处理后，得到小鼠胚胎成纤维细胞或小儿包皮成纤维细胞的细胞悬液；按照细胞个数1：1的比例混合小鼠胚胎成纤维细胞或小儿包皮成纤维细胞，得混合细胞悬液，按照0.55~0.65×105个/cm2的密度，将上述混合细胞悬液均匀铺在明胶包被的培养皿中；培养皿放入35~38℃、体积浓度为4~6％的CO2培养箱中，培养12~14h即得混合饲养层； （4）人胚胎干细胞系的建立：采用常规的机械法分离步骤（1）所得的废弃胚胎的内细胞团，将分离的内细胞团置于步骤（3）所得的混合饲养层上培养，建立人胚胎干细胞系。