[发明专利]小鼠卵巢表面上皮细胞的分离、培养、鉴定技术

摘要

本发明公开了一种小鼠卵巢表面上皮细胞的分离、培养、鉴定技术，包括步骤为：小鼠卵巢表面上皮细胞的分离与培养；免疫荧光法定性定量鉴定小鼠卵巢表面上皮细胞纯度；免疫组织化学法检测小鼠卵巢表面上皮细胞分离效果。本发明提供了一种较好的小鼠卵巢表面上皮细胞分离、培养和鉴定的方法，为更好地了解小鼠卵巢表面上皮细胞恶性转化的特征提供了实验模型，为更深入研究上皮细胞性卵巢癌的发病原因、发生发展机制，提供了新的实验手段，有助于进一步寻找卵巢癌的早期筛查指标。

主权项

一种小鼠卵巢表面上皮细胞的分离、培养、鉴定技术，其特征在于，包括以下步骤：a．小鼠卵巢表面上皮细胞的分离与培养步骤1：在超净台下，取4只6 ‑ 8周龄未生育过的健康雌性C57BL/6小鼠的卵巢，放置在含400 IU/ml青霉素、链霉素的PBS（1000 ml双蒸水, NaCl 8.0 g, KCl 0.2 g , Na2HPO4·12H2O 3.58 g , KH2PO4 0.2 g , PH为7.4）缓冲液中；步骤2：用无菌的PBS溶液轻轻冲洗卵巢3次，剥离卵巢被膜、脂肪组织及残留的输卵管组织，将剥离后的卵巢放置在装有胰酶（0.25 % 胰酶+EDTA, 27℃预热）的1.5 ml EP管中，在37℃含有5 % 二氧化碳的培养箱中消化，为使卵巢表面充分接触胰酶，应尽量使卵巢分离开来；步骤3：30 min后，从培养箱中取出1.5 ml EP管，上下摇动10次左右，取出卵巢并将其转移到另一个装有胰酶（0.25 % 胰酶+EDTA）的1.5 ml EP管中进行第二次消化,在原1.5 ml EP管中加入完全培养基终止消化，将包含有上皮细胞的液体离心（1000r/min,5 min），弃上层液，加入1 ml完全培养基缓慢吹打6 ‑ 10次，收集含小鼠卵巢表面上皮细胞的悬液，移入35 mm培养皿，在37℃含有5 % 二氧化碳的培养箱中孵育；第二次消化的步骤与第一次相同；步骤4：实验的第2 d应尽量避免移动培养皿，利于细胞贴壁生长，同时能够维持细胞周围的微环境稳定,在实验的第3 d根据细胞生长情况换液,早期传代细胞培养间隔8 ‑ 10 d按1：2比例传代，晚期传代细胞培养间隔为3 ‑ 5 d按1：5传代；b．免疫荧光法定性定量鉴定小鼠卵巢表面上皮细胞纯度步骤1：在无菌超净台中将第2代的 MOSEC用胰酶（0.25%胰酶+EDTA）消化，接种到24孔板中的爬片上，在37℃含有5 %二氧化碳的培养箱中孵育，待细胞密度达到80 %时，弃培养基，PBS漂洗3次；步骤2：用4%的多聚甲醛溶液固定细胞30 min后，用1% TritonX‑100穿透10 min再用5%封闭液室温封闭30 min；步骤3：加入1：500 稀释的一抗pan anti‑cytokeratin，在4℃湿盒中过夜，用PBS漂洗3×3 min；步骤4：加入1：1000稀释的二抗山羊抗小鼠 IgG，37℃避光反应1.5 h ，再用PBS漂洗3×3 min；步骤5： 加入10μ g/ml的DAPI，染色15 min,用PBS漂洗3×3 min，用抗淬灭剂封固，在共聚焦激光扫描显微镜下观察，在100 倍视野下每孔随机取20个视野检测，计数每个视野内的阳性细胞数( N1) 和细胞总数(N) 比值，计算细胞阳性率，阳性率= N1/ N×100 %,c．免疫组织化学法检测小鼠卵巢表面上皮细胞分离效果步骤1：同一批次的未处理过的完整小鼠卵巢和用胰酶消化过的小鼠卵巢分别放到4%甲醛中4℃过夜；步骤2：用石蜡包被卵巢后切成10 μm组织切片；步骤3：将脱石蜡的卵巢标本放到0.01 M柠檬酸钠缓冲液中煮沸10 min，PBS漂洗；步骤4：滴加正常山羊血清封闭液，待30 min甩去多余液体；步骤5：滴加1：100 的一抗pan anti‑cytokeratin 150μl，4℃过夜，PBS漂洗；步骤6：滴加1：1000 的二抗山羊抗小鼠 IgG 150μ l，置于37℃ 1 h，PBS漂洗；步骤7：DAB显色5 ‑ 10 min，PBS漂洗10 min，苏木精复染2 min，盐酸酒精分化，PBS漂洗10 ‑ 15 min ，脱水、透明、封片、镜检。