[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法

摘要

本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法，包括如下具体步骤：1、提取猪流行性腹泻病毒RNA；2、依据猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因序列设计RT-PCR引物，并扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因；3、依据猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因序列设计套式PCR引物，以RT-PCR产物为模板，扩增M基因全部片段；4、PCR产物的克隆及测序分析：将套式PCR产物进行纯化并连接到pMD18-TSimpleVector上，筛选阳性克隆，将阳性克隆进行测序鉴定。该方法能够扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因全长，通过该方法可以捕捉到猪流行性腹泻病毒在细胞培养传代过程中M全基因的序列变化，从而通过M基因的遗传变异分析了解其与PEDV毒力或者免疫效力的相关性。

主权项

一种猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法，其特征在于，包括如下具体步骤：1、提取病毒RNA:取原病料，即猪的水样粪便，经12000rpm离心5分钟后取上清液或者不同代次病毒的细胞培养液，‑20℃反复冻融2‑3次，然后采用TaKaRa miniBEST viral RNA/DNA extraction kit Ver.4.0(DV819A)提取病毒RNA;2、RT‑PCR扩增依据GENEBANK公开的猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因序列设计RT‑PCR引物，引物序列为：PEDVWF:5‑TAAGCATTACTTTCGTCC‑3PEDVWR:5‑AACTGACAGAAGCCATAA‑3以步骤1所得的病毒RNA为模板，用上述RT‑PCR引物采用TaKaRa PrimeScript one step RT‑PCR Kit Ver.2（DRR055A）扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因；3、套式PCR扩增依据GENEBANK公开的猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因序列设计PCR引物，引物序列为：PEDVNF:5‑TTACATGCGAATTGACCC‑3PEDVNR:5‑AGCTGACAGAAGCCATAA‑3以RT‑PCR产物为模板，用上述引物采用TaKaRa Premix Taq Version2.0(D334S)扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因片段；4、PCR产物的克隆及测序分析：（1）用TransGen Biotech EasyPure PCR Purification Kit(目录号EP101)对套 式PCR产物进行纯化；（2）将纯化的PCR产物连接到pMD18‑T Simple Vector载体上，筛选阳性克隆，将阳性克隆进行测序鉴定。