[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法

权利要求书

1.一种猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法，其特征在于，包括如下具体步骤：

1、提取病毒RNA:

取原病料，即猪的水样粪便，经12000rpm离心5分钟后取上清液或者不同代次病毒的细胞培养液，-20℃反复冻融2-3次，然后采用TaKaRa miniBEST viral RNA/DNA extraction kit Ver.4.0(DV819A)提取病毒RNA;

2、RT-PCR扩增

依据GENEBANK公开的猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因序列设计RT-PCR引物，引物序列为：

PEDVWF:5-TAAGCATTACTTTCGTCC-3

PEDVWR:5-AACTGACAGAAGCCATAA-3

以步骤1所得的病毒RNA为模板，用上述RT-PCR引物采用TaKaRa PrimeScript one step RT-PCR Kit Ver.2（DRR055A）扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因；

3、套式PCR扩增

依据GENEBANK公开的猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因序列设计PCR引物，引物序列为：

PEDVNF:5-TTACATGCGAATTGACCC-3

PEDVNR:5-AGCTGACAGAAGCCATAA-3

以RT-PCR产物为模板，用上述引物采用TaKaRa Premix Taq Version2.0(D334S)扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因片段；

4、PCR产物的克隆及测序分析：

（1）用TransGen Biotech EasyPure PCR Purification Kit(目录号EP101)对套式PCR产物进行纯化；

（2）将纯化的PCR产物连接到pMD18-T Simple Vector载体上，筛选阳性克隆，将阳性克隆进行测序鉴定。

2.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法，其特征在于，用TaKaRa miniBEST viral RNA/DNA extraction kit Ver.4.0(DV819A)提取病毒RNA的方法如下：

①取200μl病料处理液或冻融的细胞培养液放入1.5ml离心管中，加入200μl的Solution A,剧烈振荡混匀后，室温放置5分钟;

②加入75μl的Solution B，混合均匀后，12000rpm离心5分钟;

③将上清转移到新的Collection Tube(2ml，试剂盒中提供)中，加250μl异丙醇（1%冰乙酸），上下颠倒混匀;

④将试剂盒中的Spin column安置于另一新的Collection Tube(2ml，试剂盒中提供)上，将③中的上清液转移至Spin column中,12000rpm离心1分钟，弃滤液;

⑤将500μl的Rinse A加入至Spin column中，室温静置1分钟，12000rpm离心1分钟，弃滤液;

⑥将800μl的Rinse B加入至Spin column中,12000rpm离心1分钟，弃滤液。

⑦再次进行12000rpm离心1分钟;

⑧将Spin column安置于新的1.5ml离心管上，在Spin column膜的中央处加入50μl的灭菌蒸馏水或者Elution Buffer,室温静置1分钟;

⑨12000rpm离心1分钟洗脱病毒RNA;提取的病毒RNA立即用于后续试验或-20℃保存。

3.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法，其特征在于，采用TransGen Biotech EasyPure PCR Purification Kit(目录号EP101)进行PCR产物纯化的方法如下：

①取50-100μl的PCR产物，加入5倍体积的溶液BB，混匀后加入吸附柱中，静置1分钟10000rpm离心1分钟，弃去流出液。

②加入650μl溶液WB，10000rpm离心1分钟，弃去流出液。

③10000rpm离心1-2分钟，去除残留的WB。

④将吸附柱放于一新的1.5ml离心管中，在柱的中央加入30-50μlEB或灭菌蒸馏水（65-70℃预热EB或灭菌蒸馏水）。室温静置1分钟，10000rpm离心1分钟，洗脱DNA。洗脱的DNA立即用于后续试验或-20℃保存。