[发明专利]一种γ-亚麻酸的制备方法

摘要

一种γ-亚麻酸的制备方法，提供一种用于提高GLA产量的γ-亚麻酸的制备方法。以刺孢小克银汉霉菌（Cunninghamella echinulata ATCC 7929）为出发菌株，以葡萄糖、蔗糖、硫酸镁、磷酸氢二钾、柠檬酸三钠、柠檬酸、玉米浆作为培养基的主要原料用于培养菌株，通过添加不同种类不同浓度维生素，发酵生产γ-亚麻酸，γ-亚麻酸较对照组提高近一倍。采用接种时添加不同浓度不同种类的维生素的方法，发酵生产γ-亚麻酸，γ-亚麻酸产量较传统方法提高一倍以上，具有操作简单、成本低、设备要求低，效果佳等优势。

主权项

一种γ‑亚麻酸的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）平板活化培养：无菌条件下，将刺孢小克银汉霉菌（Cunninghamella echinulata ATCC7929）接入活化培养基斜面中，置于培养箱中培养；2）揺瓶种子培养：将培养好的菌块接入盛有摇瓶种子培养基的三角瓶中，摇床培养；3）揺瓶发酵培养：将种子液按10%的接种量接入盛有发酵培养基的摇瓶中培养，并在接种的同时，分别添加核黄素、肌醇、生物素三种维生素浓缩液，使得培养基中核黄素的浓度依次为0、0.1、5、20、35mg/L，培养基中肌醇的浓度依次为0、2、4、6、8、10mg/L，培养基中生物素的浓度依次为0、0.1、5、20、35mg/L；培养温度为28～30℃，转速为100～200rpm，发酵时间为168～192h，待菌球有些透明时，取出摇瓶；4）菌体干重的测定：将发酵液抽滤，清洗，将抽滤所得菌体置于已恒重的称量瓶中，放入烘箱中烘干后，置于干燥器中，称重；5）油脂的提取：将干菌体研磨，并称取0.5g菌体粉末于比色皿中，加2mL去离子水，混匀后加2.5mL盐酸，再混匀；将比色皿放入75℃恒温水浴箱中水浴；水浴结束后，加入2.5mL乙醇，混匀，冷却；再加入6mL乙醚，加塞震摇1min，开塞放气，再塞好静置10min，加入1mL石油醚，静置15min，将上清液取出放入小锥形瓶中；再用5mL乙醚萃取，取出上清液，重复用乙醚萃取直至上清液透明；上清液进行旋转蒸发，之后放入80℃烘箱中干燥2h，后转入干燥器冷却0.5h，称重得到0.5g菌粉中油脂含量；6）油脂的甲酯化：取油脂置于50ml的磨口烧瓶中，加入5ml 0.8mol/L KOH‑CH3OH溶液于65℃水浴回流15min进行皂化；待油珠溶解冷却后，加入5ml BF3‑CH3OH溶液，70℃水浴中甲酯化30min；取出放冷，再加入5ml正己烷振荡，然后加入足量的饱和食盐水，静置分层后取上层正己烷相，抽取上层，并加入无水碳酸钠脱水；7）γ‑亚麻酸的测定：将上层正己烷用0.22μm的有机膜过滤，各取1μl注入气相色谱仪，以保留时间定性，峰面积定量，得到γ‑亚麻酸。