[发明专利]一种贴壁培养的细胞的冷冻保存方法

摘要

本发明公开了一种贴壁培养的细胞的冷冻保存方法。该方法直接在细胞培养瓶内加入冷冻液，然后将培养瓶逐步降温，最后放入超低温冰箱中保存，可保存2-3个月，待培养条件许可时解冻细胞，继续培养。本发明冷冻与解冻步骤简单、快速，省却传统冷冻方法中的细胞消化、离心等步骤，大大降低了细胞污染以及对细胞活性的损伤；冷冻时不受细胞贴壁程度的影响（20-30%即可），打破了传统冷冻对细胞数量的限制，非常适用于应对实验室中突发情况可能对细胞培养造成的毁灭性损失；不需要购买细胞冻存管，直接利用原培养瓶冷冻，解冻后细胞也不需接种到新的培养瓶，而是在原培养瓶内加入培养液继续培养，大大节省了试验费用。

主权项

一种贴壁培养的细胞的冷冻保存方法，其特征是，将培养瓶内细胞培养液吸净，根据培养瓶型号，重新加入新鲜的细胞培养液，然后加入2×冷冻液，轻轻晃动培养瓶，让细胞培养液与2×冷冻液混匀，渗透进入贴壁细胞质内，之后将培养瓶依次平放在冰箱4℃层30‑60分钟，‑20℃层30‑40分钟，最后放在‑80℃的超低温冰箱中保存；所述2×冷冻液为：将14‑20份二甲基亚砜、2‑6份Supercool X‑1000、20‑40份胎牛血清溶解在35‑45份DMEM/F12液中，之后分装到灭菌的1.5毫升离心管中，每管0.5‑1.0毫升，放置4℃保存；上述份数均为体积份数；所述冷冻前T25型培养瓶的2×冷冻液、新鲜细胞培养液添加量均为0.5ml；T75型培养瓶的2×冷冻液、新鲜细胞培养液添加量均为1.5ml。