[发明专利]一种烟草真空渗透直接遗传转化的方法

摘要

本发明公开了一种烟草真空渗透直接遗传转化的方法，本方法将预培养后的烟草幼叶外植体浸入携带目的基因的pAHC25质粒DNA溶液中，进行真空渗透处理后，将叶外植体培养在含草丁膦的筛选培养基上，诱导外植体上形成的抗草丁膦抗性的愈伤组织分化不定芽，不定芽继续生长形成试管苗，利用PCR扩增方法鉴定携带目的基因的转基因植株。采用本发明提供的技术方案，可将目的基因直接导入烟草细胞，与农杆菌介导的遗传转化相比，减少了抑制农杆菌生长的措施；与聚乙二醇等化学方法的遗传转化相比，减少了从原生质体分离和培养的环节；与基因枪等物理方法的遗传转化相比，不需要昂贵的仪器设备，且操作技术简单。

主权项

一种烟草真空渗透直接遗传转化的方法，其特征在于，将预培养后的烟草幼叶外植体浸入浓度为0.5～1.5μg/μl的pAHC25质粒DNA溶液中，在压强为80kPa～20kPa的条件下持续保持6～15分钟，然后在大气压状态下保持30秒，重复相同的真空渗透处理2～5次；将真空渗透处理后的幼叶外植体接种到MS培养基上，黑暗条件下培养3天，再将幼叶外植体转移到含草丁膦的MS培养基上筛选培养，培养初期2周内每隔3～4天继代一次，以后每隔两周继代一次；筛选培养3～5周后，从抗草丁膦抗性的愈伤组织上再生不定芽，不定芽继续生长形成试管苗，利用PCR扩增方法鉴定转基因植株。