[发明专利]一种烟草真空渗透直接遗传转化的方法

权利要求书

1.一种烟草真空渗透直接遗传转化的方法，其特征在于，将预培养后的烟草幼叶外植体浸入浓度为0.5～1.5μg/μl的pAHC25质粒DNA溶液中，在压强为80kPa～20kPa的条件下持续保持6～15分钟，然后在大气压状态下保持30秒，重复相同的真空渗透处理2～5次；将真空渗透处理后的幼叶外植体接种到MS培养基上，黑暗条件下培养3天，再将幼叶外植体转移到含草丁膦的MS培养基上筛选培养，培养初期2周内每隔3～4天继代一次，以后每隔两周继代一次；筛选培养3～5周后，从抗草丁膦抗性的愈伤组织上再生不定芽，不定芽继续生长形成试管苗，利用PCR扩增方法鉴定转基因植株。

2.根据权利要求1所述的预培养后的幼叶外植体，其特征在于，从高20cm左右的盆栽苗上剪取幼叶，表面消毒后，剪成大小为0.3～0.5cm²的叶块，接种到MS培养基上，在温度26+1℃、光照强度4000lx、光周期为16小时光照和8小时黑暗的条件下培养3～8天后，用解剖刀切取叶块边缘长3～5mm、宽1mm左右的叶外植体，作为遗传转化的受体。

3.根据权利要求1所述的pAHC25质粒，是指携带目的基因的重组pAHC25质粒。

4.根据权利要求1和权利要求2所述的MS培养基，其特征在于，MS基本培养基中添加0.2mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.02mg/Lα-萘乙酸、3％蔗糖和0.65％琼脂；pH为5.6～5.8。