[发明专利]一种西瓜枯萎病病原菌原生质体的制备方法

摘要

本发明西瓜枯萎病病原菌原生质体的制备方法，将在PSA培养基培养获得的分生孢子接种到150mL PDB培养基上进行振荡培养，接着将培养液过滤，把过滤获得的菌丝采用0.8mol/L NaCl进行充分洗涤；之后将洗涤后的菌丝采用溶壁酶酶液溶解后依次经初次离心、二次离心以获得2-5×107个/mL的孢子液，然后将孢子液经过系列操作以获得性状稳定的转化子，即获得用于绿色荧光蛋白标记的西瓜枯萎病病原菌原生质体。本发明的优点在于：为西瓜枯萎病菌原生质体转化、基因表达等遗传操作奠定基础，且大大缩短了研究所需时间，提高了转化效率。

主权项

一种西瓜枯萎病病原菌原生质体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一、将西瓜枯萎病病原菌接种到PSA培养基上培养7天；接着将PSA培养基培养获得的分生孢子接种到150mL PDB培养基上；并将该PDB培养基置于恒温摇床上进行振荡培养24h，温度设定为28℃，转速180r/min，振荡培养结束后将培养液经4层纱布过滤获得菌丝，且将获得的菌丝采用0.8mol/L NaCl进行充分洗涤；步骤二、在50mL已灭菌的三角瓶中加入5mL预先配制好的10mg/mL溶壁酶酶液、250mg步骤一中洗涤后的菌丝，接着将该三角瓶置于恒温摇床上进行振荡培养3‑4h，温度设定为30℃，转速80r/min；振荡培养结束后采用3层擦镜纸对三角瓶内的溶液进行过滤，将过滤获得的滤液置于灭菌过的15mL尖底离心管中进行转速4000rpm、温度4℃、为时10min的初次离心以收集孢子，然后弃上清将孢子用1ml STC溶解之后再转入灭菌过的15mL尖底离心管中进行二次离心以获得2‑5×107个/mL的孢子液，二次离心的转速为3500rpm、温度为常温、时间为10min；步骤三、取5μg质粒DNA及200μl原生质体在离心管中混匀，之后将该离心管于室温下静置20min，接着加入1‑1.25ml 40％PTC至该离心管中，轻轻混匀后于室温下再放置20min以获得反应液，接着将往该反应液中加入100mL冷却至50℃的含0.9％琼脂再生培养基，该培养基中含50ug/mlarmplin和100ug/ml hygromycin B混匀后，倒于含0.9％琼脂的再生培养基上，28℃倒置培养3‑5d后获得转化子，连续转接4次至含150ug/ml潮霉素B的PDA上以筛选获得性状稳定的转化子，即获得用于绿色荧光蛋白标记的西瓜枯萎病病原菌原生质体。