[发明专利]表达法尼基焦磷酸合成酶的转基因小鼠模型的构建与应用

摘要

本发明提供一种表达FPPS的转基因动物模型的构建方法，通过在真核表达质粒PJG/a-MHC的酶切位点SalI和HindIII插入编码FPPS蛋白的DNA片段重组表达载体pJG-mFPPS，提供线性化的转基因构建物，从5’端到3’端依次包含a-MHC启动子、FPPS编码序列、HGHPolyA序列，将线性化的构建物引入非人哺乳动物的的受精卵，再移植到假孕的非人哺乳动物的输卵管，分析转基因的表达谱，阳性转基因动物与正常动物杂交，以获得子代，子代与亲代同程度地过表达FPPS。本发明的模型特异地在小鼠心脏中过表达FPPS，在FPP层面上影响小G蛋白的活化，可在效筛选抑制FPPS功能的药物中应用。

主权项

一种表达法尼基焦磷酸合成酶的转基因小鼠模型的构建方法，通过以下步骤实现：（1）重组表达载体pJG‑mFPPS：在真核表达质粒PJG/a‑MHC的酶切位点SalI和HindIII插入编码FPPS蛋白的DNA片段产生，该片段从上游到下游依次包含（i）SalI酶切位点，（ⅱ）Kozak序列，（iii）FPPS基因，（ⅳ）HindIII酶切位点；通过常规的RT‑PCR法获得FPPS基因片度，PCR使用的引物是：P1:5'‑ATATGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGAATGGGAACCAGAAATTGG ‑3'  P2:5'‑ATTGGATCCTCACTTTCTCCGTTTGTAGATC‑3' 在质粒pE‑mFPPS中用以下引物：P3:5'‑ACGCGTCGACATGAATGGGAACCAGAAATTG‑3' P4:5'‑CCCAAGCTTTCACTTTCTCCGTTTGTAGATCTTG‑3'，扩增出FPPS cDNA片段；（2）提供一线性化的转基因构建物，该构建物从5’端到3’端依次包含（a）a‑MHC启动子，（b）FPPS编码序列，（c）HGH PolyA序列，转基因构建物是在酶切位点BamHI线性化；（3）用显微注射的方法将步骤（2）中线性化的构建物引入非人哺乳动物的的受精卵；（4）将（3）中的受精卵移植到假孕的非人哺乳动物的输卵管；（5）产生的非哺乳动物的基因组中整合有FPPS表达盒，表达盒依次含有（a）a‑MHC启动子，（b）FPPS编码序列，（c）HGH PolyA序列；（6）对步骤（5）获得的转基因动物使用普通PCR法进行鉴定；使用引物是P5: 5’‑ ACGCGTCGACATGAATGGGAACCAGAAATTG ‑3’，P6: 5’‑ GCCTGGAATCCCAACAAC ‑3’；（7）通过Real‑time PCR法和Western blotting法分析转基因小鼠中的转基因的表达谱，Real‑time PCR反应β‑actin引物为P7: 5’‑CGTCAGATCCGCTAGCGCTACC‑3’, P8: 5’‑CCGGCGAGTGAGGGAAGAGTC‑3’，FPPS引物为，P9:5‑GGAGGTCCTAGAGTACAATGCC‑3’, P10 5'‑AAGCCTGGAGCAGTTCTACAC ‑3' ；(8) 阳性转基因动物与正常动物杂交，以获得子代，转基因小鼠子代与亲代同样程度地过表达FPPS。