[发明专利]真皮等同物的构建方法

摘要

本发明公开了一种真皮等同物的构建方法。首先对其人羊膜进行无菌处理，将处理后的人羊膜和硝酸纤维素膜制备成人羊膜支架；取奶山羊耳部皮肤样本，去除赃物、消毒、冲洗，将处理后所得真皮层采用0.25%的胰酶进行消化、过滤收集细胞，将收集细胞进行培养，得到真皮成纤维细胞；将牛I型胶原溶液和DMEM溶液混合均匀，并用NaOH溶液调节混合溶液的pH值，加入所得真皮成纤维细胞混合均匀，得到胶原细胞混合液；将所得胶原细胞混合液滴加在人羊膜支架上，凝固后加入培养液中，置于培养箱中培养，培养后得到真皮等同物。本发明使用人羊膜做支架，在移植时可防止真皮等同物的撕裂，增加手术的可操作性，并且术后人羊膜和生物体组织有很好的相容性，在移植初期可以吸取生物体一些营养成分，促进皮肤的愈合。

主权项

一种真皮等同物的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：a、人羊膜的无菌处理：预处理：取自剖腹产分娩产妇的胎盘，并检测胎盘的HIV、甲肝、乙肝以及梅毒血清学反应显示为阴性，将经过检测后的胎盘放入加有三抗的生理盐水中进行浸泡消毒，浸泡消毒的时间为3～4小时；海绵层的去除：在无菌间内，钝性剥离附着在预处理后胎盘上的人羊膜，将剥离下的人羊膜用加有三抗的生理盐水反复冲洗，冲洗至血液及其它污物彻底洗掉，再用含三抗的PBS缓冲液冲洗人羊膜2～5遍，冲洗后钝性剥离人羊膜上的海绵层；上皮细胞的去除：将去除海绵层的人羊膜用含三抗的PBS缓冲液冲洗1～3遍，然后将人羊膜分成数小块，上皮面向上分别平铺于玻璃平皿内，加入0.25%胰酶＋0.02% EDTA溶液，在4℃条件下冷消化12～20 h，将冷消化后的人羊膜用细胞刮去除上皮细胞，然后放入常规的DMEM培养液中培养2～5 min，再用含三抗的PBS缓冲液冲洗3～5遍，得到无菌处理后的人羊膜；b、人羊膜支架的制作：将硝酸纤维素膜剪成中空的正方形，放于塑料袋内密封，密封后进行5～15磅高压消毒，消毒后待用；将步骤a无菌处理后的人羊膜基底面向上平铺于玻璃皿内，将处理好待用的硝酸纤维素膜附于其上，然后翻转，使其上皮面向上放入另一玻璃皿内，于恒温箱内进行干燥，干燥后得到人羊膜支架；c、真皮成纤维细胞的制备：取奶山羊耳部皮肤样本0.5×0.5cm2，刮去皮肤表面赃物，用质量百分浓度为75％的酒精消毒2～4次，然后用常规D‑Hank's液冲洗3～5次，每次冲洗5min，将消毒冲洗后的皮肤样本去除表皮层，将所得真皮层剪成糜状，然后加入3～5ml、质量百分浓度为0.25%的胰酶，在37℃条件下消化5～10min，消化后过滤离心收集细胞，将收集的细胞接种培养皿中，用含有质量浓度10%血清的DMEM培养液进行培养，培养3～4天，每2天换液一次，培养后得到真皮成纤维细胞；d、真皮等同物的制备：将体积为7ml、浓度为4.5mg/ml的牛I型胶原溶液和1.5～2.5ml的5×DMEM溶液混合均匀，混合均匀后用浓度为1mol/L的NaOH溶液调节混合溶液的pH值到6.8～7.5，然后加入1～2ml步骤c所得的真皮成纤维细胞混合均匀，混合均匀后得到胶原细胞混合液；e、取4～5ml步骤d所得到的胶原细胞混合液滴加在直径为4cm的步骤b得到的人羊膜支架上，彻底凝固后得到结合有胶原细胞混合液的人羊膜支架，然后加入5～10ml含有质量百分浓度为20%血清的DMEM培养液中，然后置于CO2培养箱中培养10～15天，培养后得到真皮等同物。