[发明专利]一种使用菊粉为原料发酵生产微生物油脂的方法

摘要

一种使用菊粉为原料发酵生产微生物油脂的方法，菊粉原料经菊粉酶水解后制得菊粉水解液，再加入酵母膏、蛋白胨、磷酸二氢钾和MgSO4·7H2O制得菊粉水解液发酵培养基，在其中接种皮状丝孢酵母菌种子液发酵培养，培养结束后离心获得微生物油脂菌体，将油脂微生物菌体干燥，再用有机溶剂氯仿-甲醇法，对干燥的油脂微生物菌体细胞内的油脂进行提取，得到微生物油脂。本发明提供了一种利用菊粉生产微生物油脂的方法，极大地扩展了生物柴油的油脂原料来源，并显著降低了生物柴油原料油脂的成本，同时也解决了现有技术中菊芋块茎价值利用不充分的问题。

主权项

一种使用菊粉为原料发酵生产微生物油脂的方法，其特征在于，包含以下步骤：1）菊粉原料的水解按重量比，取7份纯度为90%的菊粉溶解到93份的蒸馏水中，加入过滤除菌的菊粉酶，加酶量为每克菊粉加入60～100U菊粉酶，在60℃条件下恒温水解8～12 h，获得菊粉水解液，备用； 2）油脂微生物的发酵培养①种子液的培养：在无菌条件下从活化后的新鲜的皮状丝孢酵母菌斜面上挑取两环菌种接种到已灭菌的豆芽汁种子液培养基中，在30℃恒温、摇瓶转速150r/min的条件下，摇瓶培养时间72h，得到发酵种子液，备用；所述的豆芽汁培养基，其制作方法为：称新鲜豆芽100g，放入烧杯中，加水1000mL，煮沸30min，用纱布过滤除去豆芽，用蒸馏水将剩余液体补充至1000mL，再加入蔗糖50g，加热溶化即可制得，所述的豆芽汁培养基在使用前在121℃条件下灭菌20min；②发酵培养：在步骤1）制得的菊粉水解液中，按每升菊粉水解液加入酵母膏5g、蛋白胨2g、磷酸二氢钾1.0g和MgSO4·7H2O 0.5g的比例将上述添加物作为氮源和无机盐加入到菊粉水解液中，搅拌溶解，再用浓度为0.2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为5.5，制得菊粉水解液发酵培养基，菊粉水解液发酵培养基在115℃条件下灭菌30min，备用；在灭菌后的菊粉水解液发酵培养基中接入步骤①中得到的发酵种子液，接入的发酵种子液的体积为菊粉水解液加入上述氮源及无机盐后总体积的10%，在恒温摇床培养箱中进行培养，培养温度为30℃，摇床转速为180r/min，发酵72h，发酵结束后在4500r/min 的转速下离心10min获得微生物油脂菌体，备用；3）微生物油脂的提取将步骤②中得到的油脂微生物菌体干燥，再用有机溶剂氯仿‑甲醇法，对干燥的油脂微生物菌体细胞内的油脂进行提取，具体操作为：按每克菌体加入浓度为4mol/L盐酸10mL的比例加入盐酸，振荡混匀，25℃恒温条件下放置30～60min，然后在100℃的沸水浴中加热3min，立即置于‑20℃环境中冷冻30min；取出后，在其中加入2倍体积的氯仿‑甲醇提取液，充分振荡2min，再按照每克菌体加入1mL氯仿的比例加入氯仿，振荡混匀，再按照每克菌体加入1.5mL蒸馏水的比例加入蒸馏水，振荡混匀后在4000r/min的离心速度下离心15～25min，分离出的氯仿层中加入等体积的质量浓度为0.1%的NaCl溶液，在4000～5000r/min的离心速度下离心15～25min，收集氯仿层，于25℃静止36h，挥发法除去氯仿，得到微生物油脂；所述的氯仿‑甲醇提取液中氯仿和甲醇的体积比为1:2。