[发明专利]一种高效提取绵羊皮肤组织蛋白的方法

摘要

本发明提供的一种高效提取绵羊皮肤组织蛋白的方法，针对绵羊皮肤组织结构的复杂性，采用冷冻破碎法粉碎组织，然后摸索出适合绵羊皮肤组织的超声破碎条件，并通过涡旋使样品裂解更充分，以便能提高皮肤组织的利用率，尽可能少地破坏蛋白内的分子结构，产出高质量的蛋白。该方法操作简单可靠，方便快捷，成本低廉，为体内皮肤组织蛋白提取提供了成熟的高效的技术方法。

主权项

1.一种高效提取绵羊皮肤组织蛋白的方法，其特征在于：分前处理、冷冻破碎、冰浴超声、蛋白定量及SDS-PAGE、Western-blot的检测步骤：步骤1.将冰浴皮肤组织样品拔毛处理，用预冷的1×PBS洗涤3次，吸干液体；称取25-30mg样品，置于预冷的2ml离心管中，将其剪碎至0.8-1mm³的小块，置于-70℃冰箱中；步骤2.取上步样品，加入直径为5-7cm无菌钢珠，置于TissueLyserLT仪器中粉碎，其频率50Hz，工作2-5min；破碎后，取出钢珠，加入预冷的蛋白酶抑制剂的裂解液，其加量为每100mg湿重组织加200-300μl，置于冰浴中超声破碎，其功率200W，工作10S，间隙15S,25次，且避免大量泡沫产生；步骤3.将超声后的样品置于漩涡混合器上涡旋30-40S，4℃、采用13000转/分钟、离心25-30分钟；提取上清液，置于-70℃冰箱中，用BCA法测定其蛋白浓度；取100μg蛋白样品加入等量的2×loadingbuffer混合均匀，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白；步骤4.采用Westernblotting免疫印迹检测蛋白的表达，即操作：将凝胶放入电转缓冲液中，湿转法100V转印60min后，加入5％脱脂奶粉室温封闭2h，用一抗鼠抗HA单抗1∶400稀释，同时以β-actin抗体1:400稀释作内参，4℃过夜孵育，用PBST洗涤5次，每次10min，用二抗为IRDye800CW标记的羊抗鼠IgG抗体1∶12000稀释，室温孵育50min，用PBST洗涤5次，每次10min，再用PBS洗涤一次，用Li-CorBiosciences扫描成像；上述裂解液配方：9M尿素2.7克，4﹪CHAPS0.2g，用高压灭菌去离子水溶解，补至5ml，冻存于-20℃冰箱中，使用前加入4﹪蛋白酶抑制剂；上述添加蛋白酶抑制剂的裂解液，其蛋白酶抑制剂与裂解液体积比为4％；上述的TissueLyserLT仪器在使用前，置于-70℃冰箱中进行预冷处置。